王曉娜 成麗

原發(fā)性卵巢惡性腫瘤是病死率最高的婦科惡性腫瘤。因其臨床癥狀隱匿，確診時多數(shù)患者已屬晚期，相當(dāng)一部分患者在手術(shù)和化療后仍會出現(xiàn)疾病的進(jìn)展或復(fù)發(fā)。因此，進(jìn)一步明確卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機制，尋找早期診斷及有效治療卵巢癌的方法成為廣大學(xué)者們研究的焦點。人抗原R(human antigen R，HuR)是人胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族中的一員，是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠與許多編碼細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白、生長因子及其受體、炎性介質(zhì)、誘導(dǎo)酶等基因的mRNA 3＇－非翻譯區(qū)結(jié)合，繼而增加這些mRNA的穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平［1］。近年來，國外對HuR在卵巢癌、乳腺癌、腦腫瘤等中研究較多［2－4］，并提出卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中HuR高表達(dá)與不良預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［2］，但國內(nèi)關(guān)于HuR在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)情況研究尚少。本文對HuR蛋白在卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)及其意義進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007至2009年在我院手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查證實的62例新鮮組織標(biāo)本。其中正常卵巢組織10例(正常組)，卵巢漿液性瘤組織標(biāo)本20例(良性組)，卵巢漿液性癌組織標(biāo)本32例(卵巢癌組)。患者術(shù)前未經(jīng)放射、化學(xué)及激素治療，所有組織標(biāo)本均由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生確診。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本制作:組織經(jīng)4%甲醛固定12 h，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，用黏附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，將載玻片放入60℃溫箱中干燥。

1.2.2 免疫組化染色(SP法):切片經(jīng)二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純乙醇及梯度乙醇直至蒸餾水水化。染色步驟嚴(yán)格按SP試劑盒說明書進(jìn)行。鼠抗人COX-2單克隆抗體、免疫組化試劑盒及染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司，兔抗人HuR單克隆抗體(美國Santa Cruz產(chǎn)品)用抗原稀釋液稀釋為1∶160，抗原修復(fù)條件為:微波抗原熱修復(fù)。pH值6.0檸檬酸作為緩沖液。二氨基聯(lián)合苯胺(DAB)染色后，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)代替一抗作陰性對照，以已知陽性的人結(jié)腸癌組織為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 所有切片采用盲法由兩位病理科醫(yī)生獨立閱片，HuR陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中。每張切片于400倍光鏡下隨機選取4個視野，采用Meta Morph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)，對其中一個具有代表意義陽性結(jié)果的視野的棕黃色顆粒進(jìn)行標(biāo)記，以此標(biāo)準(zhǔn)自動檢測所有視野的陽性結(jié)果應(yīng)用imagepro－plus(+)計算每張切片中HuR蛋白積分光密度值(IOD)，以參數(shù)積分光密度(IOD)代表蛋白顆粒密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，將灰度值取倒數(shù)，計量資料以ˉx±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組HuR瞬間表達(dá)細(xì)比較 HuR染色出現(xiàn)在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中。其在正常卵巢、卵巢漿液性瘤及卵巢漿液性癌中的表達(dá)有胞漿染色逐漸增強、胞核染色逐漸減弱的趨勢。卵巢漿液性癌中HuR蛋白的IOD，顯著高于卵巢漿液性瘤和正常卵巢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表 1。

表1 3組HuR蛋白表達(dá)比較

2.2 HuR蛋白與卵巢漿液性癌臨床病理特征的關(guān)系 HuR蛋白的表達(dá)與卵巢漿液性癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。見表2。

表2 HuR蛋白與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系ˉx±s

3 討論

真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程發(fā)生于不同的細(xì)胞部位，使得遺傳信息從DNA流向蛋白質(zhì)的過程中，可以在多點成功實現(xiàn)調(diào)控。mRNA水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是基因表達(dá)中的重要調(diào)控點，轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控可以通過改變翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性實現(xiàn)［5］，涉及這種調(diào)節(jié)的序列大多群集于轉(zhuǎn)錄本的非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)，包括5'UTR 和3'UTR。3'UTR 可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性、定位和翻譯水平。位于許多基因的3'UTR的腺嘌呤和尿嘧啶的序列(AU-rich elements，AREs)，如AUUUA和AUUUUA序列，是調(diào)節(jié)mRNA更新的最常見的順式作用元件。研究表明，多種RNA結(jié)合蛋白可以與上述順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控mRNA的降解速率。HuR蛋白是最具有代表性的RNA結(jié)合蛋白之一，HuR基因位于人類第10號染色體短臂1區(qū)3帶第二亞帶，編碼的蛋白是胚胎致死異常視覺(ELAV)家族成員之一。正常情況下，HuR蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核，但在多種條件如低氧、放射性損傷和細(xì)胞因子等刺激下可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞漿，并改變RNA的空間結(jié)構(gòu)從而抑制脫腺苷化、抑制mRNA募集至外切酶體(exosom)或阻斷可識別ARE的核酸內(nèi)切酶的活性，繼而增強mRNA的穩(wěn)定性［6］。

Denkert等［7］研究了83例原發(fā)性卵巢癌、16例卵巢交界性腫瘤、3例正常卵巢組織及9種卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR-3，SKOV-3，Mdah2774，CAOV-3，ES-2，PA-1，OAW42，A27/80，EFO-27)中HuR蛋白的表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的分布。HuR mRNA和蛋白在所有細(xì)胞系中均有表達(dá)，免疫組化方法顯示HuR蛋白在腫瘤細(xì)胞核中陽性表達(dá)率為81%，在細(xì)胞漿中陽性表達(dá)率為45%，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿中HuR陽性率與患者的預(yù)后有關(guān)，表達(dá)高者預(yù)后差。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常卵巢組織、卵巢漿液性瘤組織HuR蛋白相對含量與卵巢漿液性癌比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明在卵巢漿液性癌的發(fā)生過程中有HuR表達(dá)增強，同時HuR蛋白的表達(dá)與卵巢漿液性癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Erkinheimo等［2］研究結(jié)果一致。因此檢測各組卵巢組織中HuR蛋白的表達(dá)，有助于診斷和鑒別診斷卵巢良、惡性腫瘤，可以作為間接判斷卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)之一。同時阻斷HuR與一些基因的mRNA 3＇－UTR的結(jié)合，可以預(yù)防某些腫瘤的發(fā)生。

1 Ross J.mRNA stability in mammalian cells.Microbiol Rev，1995，59:423-429.

2 Erkinheimo TL，Lassus H，Sivula A，et al.Cytoplasmic HuR expression correlates with poor outcome and with cyclooxygenase 2 expression in serous ovarian carcinoma.Cancer Res，2003，63:7591-7594.

3 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65:2157-2161.

4 Nabors LB，Gillesp ie GY，Harkins L，et al.HuR，a RNA stability factor，is expressed in malignant brain tumors and binds to adenine and uridine－rich elements within the 3＇untranslated regions of cytokine and angiogenic factor mRNAs.Cancer Res，2001，61:2154-2161.

5 Garneau NL，Wilusz J，Wilusz CJ.The highways and byways of mRNA decay.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:113-126.

6 Wang JG，Collinge M，Ramgolam V，et al.L FA －1 －dependent HuR nuclear export and cytokine mRNA stabilization in T cell activation.J Immunol，2006，176:2105-2113.

7 Denkert C，Weichert W，Pest S，et al.Overexpression of the embryonic －lethal abnormal vision－like protein HuRin ovarian carcinoma is a prognostic factor and is associated with increased cyclooxygenase－2 expression.Cancer Res，2004，64:189-195.