李 睿，戴詩皎，戴 鍇，杜德龍，朱廷恒*

食品中非O157大腸桿菌志賀毒素基因序列分析

李 睿1，戴詩皎1，戴 鍇1，杜德龍1，朱廷恒2,*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310000)

對一株從食品中分離的非O157產(chǎn)志賀毒素1型大腸桿菌(EC6)進行研究。將該菌株所產(chǎn)志賀毒素Stx1用 PCR擴增stx1基因全長并克隆測序，其stx1基因與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的stx1基因最高同源性為99%，表明EC6發(fā)生了一定程度的基因突變。采用鄰位相連法構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明EC6為stx1基因亞型。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌；食品；stx1基因；序列分析；非O157血清型

大腸桿菌O157:H7是食品主要病原菌之一，除了O157血清型外，O111、O26等血清型大腸桿菌也能引起人類致病[1-3]。大腸桿菌致病菌主要毒力因子是志賀毒素。志賀毒素由整合到細菌基因組中的原噬菌體編碼，包括Stx1和Stx2兩種毒素類型[4]。Stx1的編碼基因stx1按照核苷酸序列的差異性可劃分為stx1、stx1c、stx1d三種亞型， Stx2的編碼基因stx2可分為stx2、stx2c、stx2d、stx2e和stx2f五種亞型[5-6]。大腸桿菌致病菌的毒力，與志賀毒素主要類型和亞型均有關(guān)。比如，志賀毒素Stx2比Stx1更容易引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等并發(fā)癥[7-8]。攜帶志賀毒素編碼基因的噬菌體能在不同血清型的大腸桿菌宿主間轉(zhuǎn)移，引起志賀毒素編碼基因的變異[9]。因此，本實驗對食品樣品中分離到的一株非O157血清型大腸桿菌志賀毒素編碼基因序列進行研究分析，以助于了解食品中污染的大腸桿菌致病菌的毒力情況，及時跟蹤食品中大腸桿菌志賀毒素基因型的流行和變遷，為開發(fā)分子快速檢測技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌EC6菌株由本文課題小組從牛肉中分離所得，經(jīng)O157和H7診斷血清凝集實驗、PCR擴增rfbEO157基因，證實為非O157血清型。

1.2 試劑

GoldView核酸染料 上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；DNA分子量標準、dNTPs、Ex Taq酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 日本Takara公司；pGEM-T Easy 載體系統(tǒng) 美國Promega 公司；AxyPrep細菌基因組DNA試劑盒 美國Axygen生物公司。

1.3儀器與設(shè)備

SW-CJ-IBV超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TGRADIENT PCR儀 德國Whatman Biometra公司；GBOX-H12-E-M自動凝膠成像分析系統(tǒng) 英國Syngene公司；DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA模板制備

將EC6菌株于LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，然后用AxyPrep 細菌基因組DNA試劑盒按照說明書提取基因組DNA。

1.4.2 stx1基因全長擴增與克隆測序

引物對見表1，引物由北京鼎國生物技術(shù)武漢分公司合成。PCR體系為：18.3μL ddH2O，2.5μL 10×Ex buffer，2μL 2.5mmol/L dNTP，0.5μL 10μmol/L引物，1μL DNA，0.2μL ExTaq DNA聚合酶。PCR擴增程序：95℃變性1min；95℃ 15s， 55℃ 30s，72℃ 90s，共40個循環(huán)；72℃延伸4min。

PCR產(chǎn)物用試劑盒純化后，連接到pGEM-T Easy 載體系統(tǒng)上進行TA克隆，熱擊轉(zhuǎn)化。然后涂布含X-Gal/ IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)，藍白斑篩選陽性重組子。將陽性菌增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，EcoRI酶切驗證。將驗證確認的兩個重組質(zhì)粒送北京鼎國生物技術(shù)武漢分公司測序。

1.4.3 序列比對分析與進化樹構(gòu)建

測序得到的stx1基因序列采用DNAstar 軟件拼接，去除多余的載體序列，得到完整的stx1基因序列。2個重組質(zhì)粒測序得到相同結(jié)果，表明測序結(jié)果可靠。然后從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載各種代表性的stx1亞型基因序列，將這些序列和測序得到的stx1基因序列一起進行多序列比對。

用Mega 4.1軟件采用鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建進化樹。根據(jù)基本的進化樹拓撲結(jié)構(gòu)，采用1000次Bootstrap抽樣對樹進行評價分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計

表1 stx1基因擴增所用引物Table 1 Sequences of primers forstx1gene amplification

EC6菌株由常規(guī)PCR鑒定出攜帶有stx1基因，不攜帶stx2基因。根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫公布的一株中國分離的O157菌株的stx1基因序列(accession number: EF079675.1)設(shè)計引物，擴增stx1基因全長。設(shè)計的引物序列見表1。

2.2 stx1基因全長擴增與克隆

本實驗室分離的非O157大腸桿菌菌株EC6經(jīng)過PCR擴增和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物與預(yù)期大小相符合，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株EC6stx1基因全長擴增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of entirestx1gene of strain EC6

EC6菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后TA克隆。提取質(zhì)粒酶切后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。未酶切質(zhì)粒大小約為4300bp，同時在3000bp和1272bp 附近可見到酶切片段，表明已經(jīng)克隆出stx1基因。質(zhì)粒電泳結(jié)果見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of restriction enzymatic digestion products of recombinant plasmid

2.3 stx1基因測序與分析

為確定克隆到的stx1基因序列，將重組質(zhì)粒送北京鼎國生物技術(shù)武漢分公司測序。測序所得的stx1核苷酸序列見圖3(5′—3′)。

圖3 菌株EC6stx1基因序列Fig.3 The sequence ofstx1gene of strain EC6

將EC6菌株的stx1基因序列在GenBank中做Blast比對，發(fā)現(xiàn)其與GenBank公布的大腸桿菌stx1基因最高同源性為99%。其中與中國分離的O157菌株(序列號：gi∣118201523∣gb∣EF079675.1)同源性為99%，僅在815位發(fā)生突變(5′—3′)。即第815位由堿基A取代了原報道的堿基C，為錯義突變，原報道的氨基酸Ala變成了氨基酸Asp。

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載stx1基因各亞型代表株序列，與EC6菌株的stx1基因序列一起比對，構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖4。

圖4 stx1基因序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based onstx1gene sequence

由圖4可知，EC6菌株與中國分離的O157菌株(序列號：gi∣118201523∣gb∣EF079675.1)同為stx1基因亞型。

3 討 論

由非O157血清型大腸桿菌致病菌引起的食物中毒近年持續(xù)上升，比如澳大利亞目前主要的流行株就是O111而不是O157[10-11]。因此檢測這些非O157血清型的致病性大腸桿菌在食品安全工作中同樣非常重要[12-14]。大腸桿菌導(dǎo)致病人發(fā)病的主要毒力因子是志賀毒素。目前國內(nèi)O157菌株志賀毒素基因序列的研究較多，但非O157血清型大腸桿菌志賀毒素基因序列的研究很少[15-16]。本研究對從食品中分離的一株非O157血清型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌EC6的stx1基因序列進行研究。測序結(jié)果表明EC6的stx1基因在一處位點有基因突變，EC6菌株與我國公布的O157菌株EF079675.1同為stx1基因亞型。stx1和其變種stx1c在臨床株中比較常見，值得引起注意。

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Sequence Analysis of Shiga Toxin Gene from Non-O157 Escherichia coli Strain Isolated from Foods

LI Rui1，DAI Shi-jiao1，DAI Kai1，DU De-long1，ZHU Ting-heng2,*
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310000, China)

A non-O157 E. coli strain (named EC6) which produces Shiga toxin type 1 was isolated from beef and the sequence of its Shiga toxin gene was analyzed. The full length of stx1 gene from strain EC6 was amplified by PCR, cloned into the pGEM-T Easy vector and sequenced. The results showed that the stx1 gene of EC6 had up to 99% similarity with the stx1 sequences deposited in GenBank database, indicating the occurrence of mutation. Furthermore, a phylogenetic tree was constructed by neighborjoining method, and according to it the stx1 gene of EC6 was stx1 genotype.

Shiga toxin-producing E. coli；food；stx1 gene；sequence analysis；non-O157 serotype

R155.5

A

1002-6630(2010)21-0236-03

2010-01-10

湖北省自然科學(xué)基金重點項目(2009CDA118)

李睿(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：liruiwuhan77@yahoo.com.cn

*通信作者：朱廷恒(1971—)，男，副教授，博士，研究方向為微生物分子生物學(xué)。E-mail：thzhu@zjut.edu.cn