王曼知，李嘉，王團(tuán)美

（長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院兒科，湖南長(zhǎng)沙 410004）

近年來(lái)，由于抗生素不合理使用等諸多因素影響致耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，再加上抗生素研發(fā)困難，耗資大，時(shí)間長(zhǎng)，因此，尋找新型抗生素及其它抗菌物質(zhì)已成為全球醫(yī)藥界面臨的緊迫問(wèn)題。人防御素具有強(qiáng)大的抗菌功能，是人體天然免疫機(jī)制的重要組成部分，是正常機(jī)體抵抗外界病原微生物入侵的重要防線，因此人們把它看作一個(gè)對(duì)付細(xì)菌耐藥的可能突破口而對(duì)其投入了極大的關(guān)注。其中，最為引人注目的是人β防御素，它在保護(hù)上皮細(xì)胞和粘膜免受感染方面起著重要作用[1,2]。與hBD-1在正常人氣道中固有、持續(xù)表達(dá)不同，hBD-3受腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細(xì)菌刺激時(shí)可表達(dá)上調(diào)[3,4]。特別是在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中，hBD-3是防御革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌及真菌感染的屏障，且相同濃度的hBD-3比hBD-1、hBD-2的抗菌活性高十倍以上，因此，它在防御呼吸道感染中更有價(jià)值。國(guó)外有學(xué)者對(duì)hBD-3在呼吸系統(tǒng)中的作用進(jìn)行了探索[3,4]。但hBD-3的表達(dá)是否與刺激時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少。因此本研究以LPS為刺激物，采用RT-PCR法檢測(cè)人支氣管上皮細(xì)胞hBD-3mRNA的表達(dá)，觀察LPS刺激不同時(shí)間后hBD-3表達(dá)量的變化，了解hBD-3表達(dá)在刺激后何時(shí)起效，持續(xù)的時(shí)間多長(zhǎng)，能否成為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白應(yīng)用于臨床，為防治呼吸道感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人支氣管上皮細(xì)胞 (購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院湘雅細(xì)胞中心)。

1.1.2 主要試劑 新生牛血清 (FCS)(杭州四季青公司)，1640(美國(guó)GIBCO公司)，LPS(E.colio L2880)及瓊脂糖(sigma公司),Trizol(invitrogen公司)，RT試劑盒(Fermentas公司)，TAG酶及dNTP(tiangen公司)，二乙基焦碳酸酯 (DEPC)(北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)，hBD-3引物及陽(yáng)性對(duì)照β-actin引物(上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

生長(zhǎng)良好人支氣管上皮細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組和4個(gè)不同濃度LPS組。其中，對(duì)照組加入含10%FCS的1640培基5mL，LPS組又分為4組，分別加入含LPS濃度為0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的10%FCS的1640培基5mL，各組均置于培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)1h、2h、4h、8h后行RT-PCR檢測(cè)hBD-3mRNA的表達(dá)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)hBD-3mRNA的表達(dá)

取不同實(shí)驗(yàn)組的支氣管上皮細(xì)胞，分別在LPS誘導(dǎo)1h、2h、4h、8h后采用Trizol法抽提RNA。依吸光度值，取等量總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，含1μL隨機(jī)引物，2μL dNTP，1μLMMLV,總體積20μL。反應(yīng)條件為：70℃ 5 min，37℃ 5 min，42℃ 60 min,70℃ 10 min。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用Tag酶，按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。上游引物為：5′-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′，下游引物為：5′-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)206bp。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min，再經(jīng)94℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照β-actin，產(chǎn)物長(zhǎng)450bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用mean±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，相關(guān)分析采用spearman檢驗(yàn)，圖表繪制采用Excel7.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

生長(zhǎng)良好的人支氣管上皮細(xì)胞鏡下顯示細(xì)胞輪廓清楚，有光澤，易貼壁，生長(zhǎng)快，背景干凈，脫落細(xì)胞少，2～3天即可長(zhǎng)滿并傳代。結(jié)果如圖1、圖2所示。

2.2 LPS刺激LPS刺激后，細(xì)胞輪廓不清楚，暗淡無(wú)光澤，貼壁細(xì)胞易脫落，生長(zhǎng)慢，背景模糊。（見圖3、圖4）。

2.3 hBD-3mRNA在對(duì)照組人支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)hBD-3mRNA在對(duì)照組人支氣管上皮細(xì)胞中有微量表達(dá)，不同時(shí)間組間(1h、2h、4h、8h)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。（見表1、圖5和圖6） 2.4 LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞hBD-3mRNA表達(dá)的時(shí)效關(guān)系

表1 不同濃度LPS不同時(shí)間點(diǎn)hBD-3mRNA的表達(dá)(mean±s)(n=8)

人支氣管上皮細(xì)胞在被不同濃度LPS(0.01、0.1、1、10μg/mL)誘導(dǎo)不同時(shí)間(1h、2h、4h、8h)后，在同一濃度組隨時(shí)間增加hBD-3mRNA表達(dá)量亦增加，呈時(shí)間相關(guān)性，不同時(shí)間組間比較有顯著性差異 (P＜0.01)。hBD-3mRNA表達(dá)的半定量結(jié)果以hBD-3/β-actin吸光度的相對(duì)值計(jì)算。（見表1、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12）

3 討論

支氣管上皮細(xì)胞覆蓋在整個(gè)氣道，是呼吸道與外界病原菌接觸的屏障。細(xì)菌感染呼吸道首先要在支氣管上皮細(xì)胞上粘附、定植，隨后產(chǎn)生毒素引起損傷。宿主亦調(diào)動(dòng)自身防御機(jī)制，抵抗細(xì)菌入侵。宿主的防御機(jī)制包括：粘液纖毛系統(tǒng)、吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、特異性體液免疫系統(tǒng)和先天性防御機(jī)制。上皮細(xì)胞分泌hBD-3，就是其先天防御機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)以人支氣管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，選擇多種革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為誘導(dǎo)物，觀察人支氣管上皮細(xì)胞被LPS誘導(dǎo)后的形態(tài)及hBD-3表達(dá)強(qiáng)弱的變化，為探索hBD-3能否作為抗菌物質(zhì)使用從而防治呼吸道細(xì)菌感染作基礎(chǔ)研究。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)良好的人支氣管上皮細(xì)胞鏡下顯示細(xì)胞輪廓清楚，有光澤，易貼壁，生長(zhǎng)快，背景干凈，脫落細(xì)胞少，2～3天即可長(zhǎng)滿并傳代。LPS刺激后，細(xì)胞輪廓不清楚，暗淡無(wú)光澤，貼壁細(xì)胞易脫落，生長(zhǎng)慢，背景模糊。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用不同濃度LPS刺激人支氣管上皮細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR對(duì)刺激不同時(shí)間后的細(xì)胞中hBD-3的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在沒有LPS刺激下，人支氣管上皮細(xì)胞中的 hBD-3mRNA有微量表達(dá)，不同時(shí)間點(diǎn)的hBD-3mRNA表達(dá)量沒有顯著性差異，推測(cè)正常人體內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞中hBD-3有少量表達(dá)，不同時(shí)間下表達(dá)恒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hBD-3mRNA在LPS刺激后1h即表達(dá)增加，推測(cè)在細(xì)菌侵襲呼吸道后，hBD-3在短時(shí)間內(nèi)即可誘導(dǎo)表達(dá)，是一個(gè)即早應(yīng)答事件，參與氣道最初的防御反應(yīng)，有望作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白應(yīng)用于臨床。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在每一濃度組，隨著LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)hBD-3mRNA表達(dá)也隨之增強(qiáng)，在一定范圍 (1h-8h)內(nèi)具有時(shí)間相關(guān)性，表明hBD-3mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)具有明顯的時(shí)效關(guān)系。并且，當(dāng)細(xì)菌存在時(shí)間越長(zhǎng)，hBD-3被誘導(dǎo)表達(dá)越多。說(shuō)明細(xì)菌感染在誘導(dǎo)hBD-3表達(dá)中占據(jù)重要地位，一旦機(jī)體受到外界病原體入侵時(shí)，即可能通過(guò)自身防御機(jī)制增強(qiáng)hBD-3表達(dá)，起到抗感染作用。如細(xì)菌感染時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，hBD-3mRNA的表達(dá)是繼續(xù)增加，還是在一定時(shí)間后衰減，尚不得而知，有望我們進(jìn)一步研究，為探討hBD-3治療的時(shí)間窗及藥代動(dòng)力學(xué)打下基礎(chǔ)。

人有兩種免疫應(yīng)答方式防御病原體入侵：先天和獲得性免疫。hBD-3在先天性免疫中主要是通過(guò)直接殺傷病原微生物來(lái)完成的。它的抗菌作用機(jī)制目前還不是十分清楚，大多數(shù)人認(rèn)為，抗菌機(jī)理和它在微生物胞膜上形成孔道有關(guān)[5，6]。hBD-3還可通過(guò)與TLR1和TLR2相互作用，誘導(dǎo)專職抗原遞呈細(xì)胞分化，從而增強(qiáng)獲得性免疫[7]。上調(diào)hBD-3可能導(dǎo)致先天性免疫增強(qiáng)，也可能導(dǎo)致獲得性免疫增強(qiáng)，產(chǎn)生直接或間接殺傷作用；上調(diào)hBD-3亦可能導(dǎo)致獲得性免疫反應(yīng)過(guò)激，產(chǎn)生不良后果。因此，隨著研究的深入，有望能通過(guò)人工調(diào)控的方式誘導(dǎo)呼吸道內(nèi)源性hBD-3的表達(dá)，殺滅病原體，使感染在局部得到有效控制達(dá)到防治呼吸道細(xì)菌感染的目的。對(duì)于某些因體內(nèi)缺乏hBD-3而導(dǎo)致易感性的疾病，如Crohn病[8]，可提供給藥的指針。

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