李 凌，陽(yáng) 云，向紅琳，曹建國(guó)★

（1.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

急性白血病是最常見(jiàn)的兒童惡性疾病，約占所有兒童惡性腫瘤的35%左右[1]。盡管近年來(lái)由于免疫學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，白血病的治療由以往的單一化療進(jìn)展為目前的多種方案綜合治療，如化療結(jié)合免疫治療、造血干細(xì)胞移植、分子靶向治療等，但目前化療在白血病的治療中仍占據(jù)著不可替代的重要地位[2]。雖然大部分的病人對(duì)于現(xiàn)在的治療有效，但仍有很高比例病人對(duì)治療不敏感或治療后復(fù)發(fā)。因此，發(fā)現(xiàn)新的具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡作用的藥物是當(dāng)前的研究前沿領(lǐng)域。

白楊素 (5,7-二羥黃酮，ChR)是一種從多種植物、蜂蜜和蜂膠中提取得到的天然的生物活性黃酮化合物。近年來(lái)，ChR的抗腫瘤作用和化療增敏作用引起了醫(yī)藥研究工作者的極大興趣。有研究報(bào)道指出：ChR通過(guò)激活Caspase和滅活A(yù)kt誘導(dǎo)白血病U937細(xì)胞凋亡[3]；但由于ChR在腸道吸收甚少和5,7-位羥基在體內(nèi)被迅速糖基化代謝導(dǎo)致活性較低，限制了它的臨床應(yīng)用[4]。8-溴-7-甲氧基白楊素(8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin,BrMC)是我們自主設(shè)計(jì)、合成、篩選得到的一種抗腫瘤作用較白楊素更強(qiáng)的新型白楊素衍生物[5,6]。本文旨在觀察BrMC誘導(dǎo)人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

8-溴-7-甲氧基白楊素(BrMC)按照文獻(xiàn)[5]的方法由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室合成。三氧化二砷 (Sigmma公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)、小牛血清(Invitrogen公司)、細(xì)胞死亡ELISA檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)、二氯熒光素二乙酯(美國(guó)Molecular Probes Inc公司)和N-乙酰半胱氨酸(Sigmma公司)購(gòu)自湖南科泰生物技術(shù)有限公司(中國(guó)長(zhǎng)沙)。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自碧云天公司(中國(guó)長(zhǎng)沙)。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人急性T淋巴細(xì)胞性白血病Jurkat細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，置于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 FITC標(biāo)記Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析

取經(jīng)藥物或溶媒處理的 Jurkat細(xì)胞 1× 106，1000g離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)和5μL Annexin V-FITC，室溫(20-25℃)避光孵育10min。然后，1000 g離心5min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)和10μL碘化丙啶染色液，混勻，立即用EPICS-XL流式細(xì)胞儀 (美國(guó)COULTER公司)檢測(cè)Annexin VFITC陽(yáng)性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI雙染陽(yáng)性(晚期凋亡)細(xì)胞百分率。

1.4 組蛋白/DNA碎片的含量測(cè)定

參照細(xì)胞死亡ELISA檢測(cè)試劑盒 (羅氏公司)說(shuō)明書(shū)描述的步驟操作，用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以405nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值。

1.5 細(xì)胞活性氧測(cè)定

按照文獻(xiàn)[7]的方法，采用DCFH-DA探針FCM檢測(cè)細(xì)胞活性氧生成。收集2.0×106個(gè)處理后的Jurkat細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗三次，重懸于1mL的10μmol/L DCFH-DA探針液中，37℃暗室孵育30min，每隔3～5min顛倒混勻一次，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA后，立即用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀以488nm為激發(fā)波長(zhǎng)，525nm為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以mean±s表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。方差具有齊性，用LSD法進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較；方差不齊，采用Dunnet T3法進(jìn)行多樣本均數(shù)之間的兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BrMC對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡率的影響

圖1示：BrMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞系A(chǔ)nnexin VFITC陽(yáng)性(早期凋亡)和Annexin V-FITC/PI雙染陽(yáng)性(晚期凋亡)細(xì)胞百分率增高，呈濃度依賴性(P＜0.05)。

圖1 BrMC增加Jurkat細(xì)胞系A(chǔ)nnexin V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞百分率

2.2 BrMC對(duì)Jurkat細(xì)胞組蛋白/DNA碎片的影響

圖2表明：BrMC以濃度依賴方式增加Jurkat細(xì)胞組蛋白/DNA碎片(P＜0.05)。

經(jīng)標(biāo)示濃度受試物處理24 h的Jurkat細(xì)胞，ELISA法測(cè)定細(xì)胞組蛋白/DNA碎片。數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)?！颬＜0.05;★★P＜0.001;★★★P＜0.001,與溶媒組比較。#P＜0.05;##P＜0.001，與1 μM BrMC處理組比較。

2.3 BrMC對(duì)Jurkat細(xì)胞活性氧的影響

圖3顯示：BrMC促進(jìn)Jurkat細(xì)胞活性氧生成，10 mmol/L NAC預(yù)孵育能有效阻斷BrMC誘導(dǎo)活性氧生成(P＜0.05)。

經(jīng)標(biāo)示濃度受試物處理3 h的Jurkat細(xì)胞，DCFH-DA標(biāo)記FCM分析熒光強(qiáng)度(MFI)。數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)?！铩颬＜0.001;★★★P＜0.001,與溶媒組比較。#P＜0.05;##P＜0.01，與10 mM NAC+ BrMC處理組比較。

2.4 NAC對(duì)BrMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

圖4證明：氧自由基清除劑NAC(10 mmol/L)顯著拮抗BrMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率增高和組蛋白/DNA碎片增加作用(P＜0.05)。

經(jīng)標(biāo)示濃度受試物處理24 h的Jurkat細(xì)胞，A，Annexin V-FITC/PI雙染色 FCM 分析；B，ELISA法測(cè)定細(xì)胞組蛋白/DNA碎片。數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)?！颬＜0.05;★★P＜0.001;★★★P＜0.001,與溶媒組比較。#P＜0.05，與10 mM NAC+相同濃度BrMC處理組比較。

3 討論

目前，AML的治療以化學(xué)治療和骨髓移植為主。采取的具體策略有：⑴抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；⑵誘導(dǎo)分化；⑶誘導(dǎo)凋亡；⑷免疫療法和生物治療；⑸基因治療[2]。雖然大部分的病人對(duì)于現(xiàn)在的治療有效，但仍有很高比例病人對(duì)治療不敏感或治療后復(fù)發(fā)。BrMC是在前期研究中，自主設(shè)計(jì)、合成、篩選得到的一種抗腫瘤作用較白楊素更強(qiáng)的新型白楊素衍生物[5,6]。本文的主要研究目的是探討B(tài)rMC是否具有誘導(dǎo)白血病Jurkat細(xì)胞凋亡作用以及該作用是否涉及BrMC促進(jìn)活性氧生成。

本文首先檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的重要的生化特征即位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻至細(xì)胞膜外側(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BrMC以濃度依賴方式增高體外培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞凋亡率。其二，本文測(cè)定細(xì)胞凋亡晚期基因DNA斷裂，形成組蛋白/DNA碎片。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)BrMC增加體外培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞組蛋白/DNA碎片。以上結(jié)果證明，BrMC具有誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡作用，呈濃度依賴性。其三，本文采用DCFH-DA熒光探針標(biāo)記 FCM分析不同濃度BrMC作用體外培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞3 h的活性氧水平。結(jié)果顯示，BrMC能有效促進(jìn)體外培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞活性氧生成，同時(shí)氧自由基清除劑NAC(10 mM)預(yù)孵育完全阻斷BrMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞活性氧生成作用。最后，本文結(jié)果還發(fā)現(xiàn)10mM NAC預(yù)孵育能夠部分拮抗BrMC誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡作用；從而說(shuō)明BrMC促進(jìn)活性氧生成是其誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。因此，本文的結(jié)論是BrMC具有誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡作用，且至少部分是通過(guò)促進(jìn)活性氧生成發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。

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