周 亮 申偉華 唐 暉

（湖南科技大學(xué)體育學(xué)院，湖南湘潭411201）

動脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS）是危害人類健康的一種常見老年疾病。研究表明，有氧運動是改善心血管健康，預(yù)防和輔助治療動脈粥樣硬化的有效手段。已知運動改善心血管健康與促進血管內(nèi)皮細胞的NO釋放、改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能有關(guān)，但是不明確何種強度和多長時間的運動為最適宜刺激。血管內(nèi)皮依賴性舒張功能主要受NO和ET兩種信號分子的調(diào)節(jié)，NO為內(nèi)皮細胞釋放的舒張血管物質(zhì)，而ET是已知的最為有效的收縮血管的物質(zhì)。內(nèi)皮細胞的NO釋放受一些因素的調(diào)節(jié)，其中NOS是NO合成的關(guān)鍵限速酶，L-Arg可以有效促進NO釋放，但是L-Arg的競爭抑制物ADMA卻抑制內(nèi)皮的NO釋放。關(guān)于不同運動持續(xù)時間對血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響鮮見報道，本研究試圖探索不同運動時間對內(nèi)皮NO釋放量和一些調(diào)節(jié)內(nèi)皮NO釋放的因素的影響，為運動抗動脈粥樣硬化提供實驗支持并探索合適的運動時間。

1 實驗對象和方法

1.1 實驗對象

雄性SD大鼠60只，9周齡，體重250±10g，為II級實驗動物，購于中南大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物學(xué)部。室溫20～24℃，自然光照，自由飲食、飲水，每籠5只飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 動物模型的建立

依照參考文獻，給予AS、ASL、ASM和ASH組高脂飼料，高脂飼料配方:大鼠標準飼料中加1%膽固醇，0.35%膽酸鈉，5%豬油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前三天按70萬IU/kg的總劑量分三次灌胃給予維生素D3。動物建模時間為6周，6周后進行動物模型檢驗。

1.3 動物分組

于動物模型建立實驗前，隨機選取10只為對照組，未進行動物建模。建模成功大鼠隨機分為五組，C組 （正常對照組）、AS組 （動脈粥樣硬化模型組）、ASS組 （動脈粥樣硬化+30 min有氧運動）、ASM組 （動脈粥樣硬化+60 min有氧運動）、ASL（動脈粥樣硬化+90 min有氧運動），每組各10只。

1.4 有氧訓(xùn)練安排

以上動物分組后進行三天的跑臺訓(xùn)練，然后進行正式運動實驗。根據(jù)參考文獻和本實驗室的前期成果，大鼠跑臺運動強度跑速為20 m/min。三個運動組的運動時間分別設(shè)計為30 min、60 min、和90 min。實驗持續(xù)時間為4周，每周訓(xùn)練6天，每天一次訓(xùn)練。

1.5 測試方法

1.5.1 動物模型檢驗

動物模型建立為6周時間，建模后每組取3只處死，提取主動脈環(huán)，主動脈切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察檢驗?zāi)Ｐ徒⑹欠癯晒Α?/p>

1.5.2 動物取材

訓(xùn)練結(jié)束后即刻用戊巴比妥鈉腹腔麻醉、宰殺，腹主動脈取血。血液提取后靜置30 min，3000轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清，-80超低溫冰箱保存，供實驗分析。

1.5.3 NO和NOS測定

NO和NOS的測定均采用購自南京建成生物研究所的試劑盒測定，NO測定采用硝酸還原酶法，NOS測定采用比色法，實驗過程嚴格按試劑盒說明進行。

1.5.4 ET的測定

放免法。試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，實驗過程嚴格按試劑盒說明進行。

1.5.5 血漿ADMA和L-Arg測定

根據(jù)文獻，處理樣品。按1 ml血清加入20 mg的5-磺基水楊酸 （salicylsulfonic acid，SSA）沉淀蛋白，冰浴反應(yīng)10 min，離心 （2 000g，10 min），吸取上清，0.45μ m的濾膜過濾后待測。L-Arg和ADMA標準品用50%甲醇配成100 mg/mL左右濃度的儲備液，-20℃儲存。臨用前用人工腦脊液（NaCl 7.605 g，KCl 0.223g，NaH2PO4?2H2O 0.072 g，NaHPO4?12H2O 0.014 g，NaHCO32.1 g，MgCl2?6H2O 0.162 g，CaCl20.144 g，溶解后定容至1 000 mL，pH=7.4）稀釋后測定，稀釋倍數(shù)分別為80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。將27 mg鄰苯二甲醛 （OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入 2-巰基乙醇 （2-MCE）20μ L，加入0.1 mmol/L四硼酸鈉緩沖液 （pH=9.5）至5 mL制得衍生液，避光室溫保存。上樣前將20μ L標準液或樣品液與10μ L衍生液混勻，精確反應(yīng)90 s，進樣20μ L。流動相包括四種，各自成分如下:流動相A:100%甲醇，流動相B:純水，流動相C:25%甲醇，3%四氫呋喃，72%0.05M PBS，流動相D:70%甲醇，3%四氫呋喃，27%0.05M PBS，流動相均經(jīng)0.45μ m濾膜過濾，超聲波脫氣后使用。采用Waters HPLC系統(tǒng)，分析柱為Inertsil ODS-2，流速為1 mL/min，溫度為30℃，熒光檢測調(diào)節(jié)為激發(fā)光338 nm、發(fā)射光425nm。

根據(jù)標準品作出標準曲線，計算出函數(shù)，將所測樣品的峰面積分別代入函數(shù)，計算 L-Arg及ADMA水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 動物模型檢驗

對照組動脈各層結(jié)構(gòu)完整，無鈣化及脂肪沉淀。各造模組大鼠主動脈切片可見內(nèi)膜細胞增生及內(nèi)皮下出現(xiàn)淡染的空泡等動脈粥樣硬化的早期病變，有些部位可見中膜平滑肌細胞增生、排列紊亂或隆起呈斑塊狀結(jié)構(gòu)，有些部位中膜有明顯的鈣化形成，說明造模成功。

2.2 血清NO、NOS和ET濃度變化

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化各組的血清NO濃度無論在有氧訓(xùn)練前和運動訓(xùn)練安排的各時段均明顯低于對照組，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。無論運動時間的長短，均可明顯改善血管內(nèi)皮的NO釋放量，數(shù)據(jù)顯示各運動組的NO值均明顯高于安靜對照組和AS模型組。動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，NOS的活力降低，AS模型組的NOS活性明顯低于安靜對照組，而有氧練習(xí)，不論時間長短，均可改善NOS的活性，各運動組NOS活性明顯提高，與模型組比較有顯著意義。ET水平在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中明顯升高，有氧練習(xí)顯著的降低血清的 ET水平。（見表1）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

注:1）與對照組相比較P＜0.05; 2）與AS組比較P＜0.05

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2.3 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-Arg的水平各組都沒有明顯變化，動脈粥樣硬化模型組的L-Arg和安靜對照組及各運動組比較逗沒有顯著差異。而血清ADMA水平在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中有明顯上升，模型組和對照組相比有顯著差異。短時間的有氧練習(xí) （30 min）對血清ADMA的影響不大，ASS組和模型組相比較沒有顯著差異，而較長時間的有氧練習(xí)明顯降低血清ADMA水平，ASM組和ASL組與模型組相比較都有顯著差異。實驗結(jié)果還顯示，動脈粥樣硬化發(fā)病過程中 L-Arg/ADMA比值明顯降低，不同時間的有氧練習(xí)均可以提高這一比值。

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

注:1）與對照組比較P＜0.05;2）與AS及ASL組比較P＜0.05

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3 討論

大量實驗證實，規(guī)則、周期性、中小運動強度的有氧運動可以預(yù)防動脈硬化，改善心血管健康。Maiorana A教授認為，運動改善心血管健康主要通過NO途徑實現(xiàn)，當(dāng)前關(guān)于運動誘導(dǎo)NO釋放改善心血管健康的關(guān)鍵問題是:何種強度以及多長時間的運動更為有利。在動物實驗中，動物運動量和運動強度的把握，成為能否得到合理的實驗結(jié)果的制約因素。本實驗采用遞增運動負荷，靶強度為20 m/min，一次運動時間60 min的運動方案，根據(jù)加拿大學(xué)者Fernando研究的推斷，應(yīng)為中等強度有氧運動。經(jīng)本實驗室前期研究表明，這一強度的有氧練習(xí)可以有效改善動脈粥樣硬化的大鼠的血清NO釋放量。

動脈粥樣硬化 （athemsclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，它是由內(nèi)皮細胞功能受損導(dǎo)致血管擴張和收縮功能障礙引起的。ET是內(nèi)皮細胞分泌的一種最強的縮血管活性多肽，NO是一種很強的舒血管物質(zhì)。正常情況下，內(nèi)皮細胞所分泌的ET、NO應(yīng)該處于一種平衡狀態(tài)，AS的內(nèi)皮細胞功能異常主要表現(xiàn)為ET、NO的失衡。對于運動時內(nèi)皮細胞功能改變的AS，有學(xué)者研究指出:NO是一種體內(nèi)氧自由基清除劑，NO生成越少，則過氧化物生成越多，可促進AS的形成。本研究顯示，大鼠在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，血清NO量明顯降低，血清ET含量明顯上升，這和大部分的報道一致。不同實驗發(fā)現(xiàn)，不同時間的有氧練習(xí)均有利于增加血清的NO釋放量，提示各種強度的有氧練習(xí)均有利于改善心血管健康。但是不同時間的有氧練習(xí)對ET釋放的影響不一，長時間練習(xí)的效果明顯優(yōu)于短時間的練習(xí)。

一氧化氮的生成主要通過NOS，利用L-Arg為底物合成。NO的生成依賴于NOS的活性和LArg的可利用度。一些學(xué)者假設(shè)給予L-Arg可能具有治療作用。，Adams等進行的一項以經(jīng)血管造影證實的冠心病患者為研究對象的實驗中，10名患者隨機分為2組.L-Arg組給予口服 L-Arg，連用3天，對照組給予安慰劑口服，結(jié)果顯示內(nèi)皮依賴性肱動脈舒張功能在L-Arg組得以改善。本實驗發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，NOS活性降低，各運動組均可明顯提高血清NOS活性，與模型組相比有顯著意義的差異。

內(nèi)源性NOS抑制物為L-精氨酸的同系物，其中研究較多的是不對稱二甲基精氨酸 （ADMA），其競爭性抑制NOS活性，使NO的抗動脈硬化作用減弱，導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。自ADMA第一次被認為是一氧化氮 （NO）途徑內(nèi)源性抑制劑以來，它在調(diào)節(jié)NO產(chǎn)生中所起的作用越來越受到重視。在動脈中輸人ADMA能夠引起血管收縮。當(dāng)前的實驗和l臨床數(shù)據(jù)表明ADMA濃度的輕微改變能顯著影響血管NO的產(chǎn)生，血管緊張度和全身血管抵抗。這表明ADMA可以作為一個內(nèi)皮細胞功能紊亂的標記。因此，L-Arg/ADMA比值被認為是評價動脈粥樣硬化風(fēng)險的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，血清L-Arg值變化很小。但是，本實驗也發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化模型組的血清ADMA值明顯升高，而L-Arg/ADMA比值下降。實驗結(jié)果表明，運動不會影響L-Arg水平，但是會降低 ADMA水平，從而改善 LArg/ADMA比值。

4 結(jié)論

4.1 實驗結(jié)果顯示，無論多長時間的有氧運動均可以顯著提高血清NO水平并明顯提高血清NOS的含量;不同時間的有氧練習(xí)均降低血清ET水平，但是較長時間的運動效果更為明顯。

4.2 動脈粥樣硬化發(fā)展過程中L-Arg濃度變化并不明顯，但是ADMA水平明顯上升。各種不同時間的有氧練習(xí)也不會改變血清L-Arg水平，但是較長時間的有氧練習(xí)有利于降低血清ADMA水平，因此可以有效改善L-Arg/ADMA比值。

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