于源華，宋禹，何秀霞，王寶德，劉華，李金海，熊光明

(1.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022；2.長春衛(wèi)爾賽生物藥業(yè)有限公司，長春 130022)

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水資源甾體激素污染愈加嚴重，這不僅僅危害人類健康而且危及到所有動物的生存和發(fā)展[1]。甾體激素在江水、河水、湖水及海水中都被檢出[2-3]。其含量超標(biāo)可能造成男性女性化，還將引起男性前列腺癌，女性乳腺癌等[4]。

另有美國Julio E.Cabrera學(xué)者[9]報道了3,17-羥基類固醇脫氫酶基因，其編碼的3,17-HSD能夠降解固醇類固醇激素，如果從中國領(lǐng)域內(nèi)篩選到相關(guān)的菌種并克隆出關(guān)鍵基因?qū)槲覀冎卫砣找鎳乐氐沫h(huán)境激素污染起到重要作用。

1 材料

海水樣品：采樣地點位于大連海港附近，疑為被城市甾體激素污染。

菌種：HB101(實驗室保存)。

質(zhì)粒：pCR2.1-TOPO(Invitrogen購買)。

試劑：LB培養(yǎng)基，SIN培養(yǎng)基，kannmycin(北京鼎國)，雌二醇，睪丸酮，膽固醇(sigma)，3-HSD/CR兔抗體(本實驗室制備)。

儀器：熒光酶標(biāo)儀(BioTek)，全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，日立CF-16RX高速冷凍離心機，紫外分光光度計(日立U-2800)PCR儀(eppendorf)。

2 方法

2.1 環(huán)境中甾體激素降解菌的篩選

從大連海港8個不同地點取了8種水樣。將水樣至于50mL離心管中，4000rpm，離心10min。取靠近底部沉淀物的2mL水至于EP管中，取400uL在含有2.6%NaCl和1mM睪丸酮的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基上涂布，27℃過夜培養(yǎng)。挑取8個平板的單菌落(每個平板5個單菌落)到50uLSIN培養(yǎng)基中并編號記錄，混勻后各取2uL分別在A(無睪丸酮)和B(含有1mM 睪丸酮)平板上點樣。27℃過夜培養(yǎng)。A、B平板為1:10稀釋的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基，含2.6%NaCl。

2.2 H5-1菌株的培養(yǎng)

H5-1菌株在含2.6%NaCl的 LB培養(yǎng)基中，27℃，180rpm，恒溫搖床里培養(yǎng)12h備用。接于新的含2.6%NaCl的LB培養(yǎng)基中，27℃，180rpm恒溫搖床里擴大培養(yǎng)5-6h備用。H5-1菌株在含 kan(30g/ml)2.6%NaCl的 LB 培養(yǎng)基，27℃，180rpm的恒溫搖床里培養(yǎng)12h備用。

2.3 ELISA檢測3-HSD/CR

2.4 3，17-羥基類固醇脫氫酶(3，17-HSD)目的基因的克隆

根據(jù)GeneBank中報道的EF488080.1的3,17-HSD基因序列設(shè)計上下游引物，以 H5-1染色體DNA為模板，上游引物 P3-17L:5'-CATATGACAAATCGTTTGCAG-3'，下游引物P3-17R:5'-GGATC CATCTATAGCCCCATG-3'得到765bp的3,17-HSD基因片段。將該片段與載體 PCR2.1-TOPO連接制得pTOPO-3,17-HSD并轉(zhuǎn)化到HB101感受態(tài)細胞中，通過Kan、Amp雙抗性篩選得到HB-17突變菌株。再通過電擊與 H5-1菌株雜交，抗性篩選出H5-1突變株。

2.5 ELISA檢測3，17-HSD

為了定量3,17-HSD，建立 ElISA檢測方法，抗 3,17-HSD兔抗體由本實驗室按照標(biāo)準方法制備。將含3,17-HSD蛋白樣品包被在酶標(biāo)板上，蛋白含量定于 1mg/mL，封閉洗滌之后每孔加入200uL1:10000稀釋的3,17-HSD抗體，加入二抗染色終止。

圖1 篩選降解水中雌激素的細菌Fig.1 The bacteria of estrogen in screening degradated water

圖2 H5-1的顯微鏡下結(jié)構(gòu)觀察圖Fig.2 The structure graph under HS-1 microscope

圖3 不同溫度條件下甾體激素誘導(dǎo)H5-1表達3-HSD/CR蛋白Fig.3 The steroid hormone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different temperature

圖4 不同濃度的甾體激素誘導(dǎo)H5-1表達3-HSD/CR蛋白Fig.4 The steroed homone induce H5-1 express 3-HSD/CR protein in different density

圖5 H5-1菌株對膽固醇的降解作用Fig.5 The degradation of cholesterol by strain

3 結(jié)果

3.1 菌株篩選

通過27℃過夜培養(yǎng)，所有的40接種單菌落在B平板上均能良好生長，只有8個接種單菌落不能在A平板上生長(圖1)。很明顯，這8個菌落在B平板上可以利用睪丸酮作為碳源生長，而在同樣低營養(yǎng)條件且不含睪丸酮的A平板上無法生長。根據(jù)進一步的篩選，(第3次接種于1：10稀釋的SIN瓊脂糖培養(yǎng)基，含2.6%NaCl，1mM睪丸酮)從這8單菌落中得到一個單菌落，這種菌具有與睪丸酮叢毛單胞菌相似的特性，命名為H5-1。

A、B均為1：10稀釋的SIN培養(yǎng)基且含2.6%NaCl，B中另含有1mM睪丸酮。

經(jīng)過革蘭氏染色后的 H5-1的顯微鏡下照片顯示為革蘭氏陰性菌(圖2)。

3.2 H5-1中3-HSD/CR活性

在不同濃度和不同溫度條件下H5-1被雌二醇，睪丸酮誘導(dǎo)均可以使3-HSD/CR不同程度大量表達，但被膽固醇誘導(dǎo)3-HSD/CR表達量卻沒有增加。而且H5-1最適誘導(dǎo)溫度為27℃至37℃，最適誘導(dǎo)濃度為0.3mM(圖3、4)。

3.3 H5-1對膽固醇的降解

為了確定H5-1的降解能力及H5-1是否對膽固醇有降解作用，我們將培養(yǎng)好的 H5-1菌液加入到已知膽固醇含量的測試液中，恒溫27℃，1h后檢測測試液中的膽固醇含量。

由加入 H5-1菌液前后測試液中的膽固醇濃度可知，27℃1h后，測試液中0.5mM的膽固醇80%以上被降解(圖5)。

3.4 3，17-HSD的基因克隆

圖6 3，17-HSD基因PCR電泳圖Fig.6 The electrophoretic graph of 3，17-HSD gene

此圖顯示了3條PCR擴增條帶，分別是740bp、600bp、380bp。

4 討論

該基因的成功克隆，為本課題組進行目的蛋白的表達、酶活性測定研究及利用分子克隆技術(shù)將綠色熒光蛋白報告基因(GFP)通過同源重組整合進H5-1染色體 DNA中，構(gòu)建出H5-1熒光變異菌株奠定了工作基礎(chǔ)。

[1]ColbornT，F(xiàn) S vomSaal，SotoAM.Developmentaleffects of endocrinedisruptingchemicals in wildlife and humans[J].Environ Health Perspect，1993，101：378-384.

[2]Barel-Cohen K，Shore L S，Shemesh M，et al.Kronfeld-Schor，Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river[J].J Environ Manage，2006，78：16-23.

[3]Wu Wenzhong，Wang Jingxian，Xu Ying，et al.Recombinant gene yeast for assaying environmentalestrogen pollutants[J].China Environm ental Science，2002，22(1)：31-32.

[4]ZHAO Zewen，Chang Qing，Zhi-Qing Liang.Environmental health effects of estrogen[J].Chinese Clinical Rehabilitation，2004，8(9)：1724-1725.

[5]Guangming Xiong，Yijing Luo，Saihong Jin.Edmund Maser，Cis-and trans-regulatory elements of 3_-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase as biosensor system for steroid determination in the environment[J].Chemico-Biological Interactions，2009：178，215-220.

[6]Guangming Xiong，Hans-Jorg Martin，Andreas Blum，et al.A model on the regulation of 3-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase expression in Comamonas testosteroni[J].Chemico-Biological Interactions，2001，130-132 ：723-736.

[7]陳瀟瑩.3-羥類固醇脫氫酶抗體的制備及標(biāo)記[D].長春理工大學(xué)研究生畢業(yè)論文，2006.

[8]刁昱文.甾體激素ELISA檢測方法研究[D].長春理工大學(xué)研究生畢業(yè)論文，2006.

[9]Julio E Cabreraa，JoseA L.Pruneda Pazb，S.Genti-Raimondi，Steroid-inducible transcription of the 3b/17b-hydroxysteroid dehydrogenase gene(3b/17b-hsd)in Comamonas testosterone[J].Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology，2000，73：147-152.

[10]Yu Yuanhua.Basis experimental course of bio-engineering and technical[M].BeiJing：Weapon Industry Press，2007：127-132.

[11]Xiong G，Lutz F.Site-directed mutagenesis of the Pseudomonas aeruginosa cytotoxin for probing toxic activity[J].Eur J Biochem，1992，204 ：789-792.