胡 濱, 陳一資＊, 辜雪冬

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,雅安625014;2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,林芝860000)

硒是人體必需的微量元素之一,它具有清除體內(nèi)自由基、提高免疫力以及拮抗重金屬等方面的生物學(xué)功能,它還與人類心血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病以及骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生具有相關(guān)性[1-2],因此作為一種保健食品原料已廣泛應(yīng)用。但硒的安全劑量和中毒劑量之間的范圍相當(dāng)狹小,一旦超出其安全劑量,就會引起人體的硒中毒[3-5]。本試驗旨在用保健食品常見的硒強(qiáng)化劑亞硒酸鈉對小鼠進(jìn)行不同劑量灌胃,通過急性、蓄積性毒性試驗,建立小鼠硒中毒的動物模型,為硒的毒理學(xué)安全性評價積累資料。通過硒對小鼠生長性能變化、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、主要器官組織病理學(xué)變化等進(jìn)行系統(tǒng)綜合研究,了解高濃度硒的危害,防止由于硒攝入過量而對人造成毒害,為生產(chǎn)富硒保健食品和食品監(jiān)督部門的安全監(jiān)管提供可靠科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 清潔級昆明種小鼠180只,雌雄各半,體重20±2g,成都實驗動物中心提供。小鼠專用生長維持飼料:成都實驗動物中心提供。飼養(yǎng)溫度 22～25℃,濕度40%～60%,自然采光條件。

1.1.2 受試物 亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O):分析純,含量>99%,成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

1.1.3 主要器材和試劑 全自動生化分析儀:7020型,日立電子公司生產(chǎn);電子天平:TE412-L型,德國賽多利斯公司生產(chǎn);超純水儀:Milli-Q型,美國密理博Millipore公司生產(chǎn);硫酸,硝酸,高氯酸,鹽酸,氫氧化鉀,高錳酸鉀,乙醇等,均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

1)預(yù)實驗 將亞硒酸鈉用超純水溶解后配成不同濃度溶液,再按小鼠體質(zhì)量灌胃。取小鼠70只隨機(jī)分為7個組,每組10只,禁食14 h,不禁水,采用一次性灌胃給藥。用藥劑量分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/kg。灌胃后連續(xù)觀察 7 d[6]。

2)正式試驗 根據(jù)預(yù)備試驗所得最小致死劑量a=2.0 mg/kg,最大致死劑量b=8.0 mg/kg,則組間劑量比急性毒性正式實驗設(shè)置5個劑量組和1個對照組,每組10只,每組分別按 2.0、2.82、3.98、5.61、7.90 mg/kg 劑量一次性灌胃,對照組以超純水進(jìn)行灌胃。灌胃后連續(xù)觀察7 d,觀察小鼠精神、食欲、飲水、活動并記錄小鼠中毒情況、死亡時間和死亡只數(shù)[6]。

1.2.2 蓄積性毒性實驗

1)動物的分組和給藥 采用20d蓄積性毒性試驗法來判斷硒對小鼠的蓄積毒性強(qiáng)度。設(shè)置4個試驗組和1個對照組,每組10只。試驗組分別按1/20、1/10、1/5、1/2 LD50劑量每日灌胃一次 ,對照組灌胃超純水,連續(xù)灌胃20 d。

2)檢查內(nèi)容 觀察記錄各組小鼠的精神、活動、飲水、食欲等變化,并記錄死亡情況。在實驗第21天剖殺全部小鼠取血及主要臟器,系統(tǒng)研究亞硒酸鈉對小鼠臟器指數(shù),剖解、組織病理變化,血常規(guī)、血液生化等的影響[6]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

試驗Ⅴ組、Ⅳ組小鼠在灌胃4 min后開始出現(xiàn)小鼠活動減少,嗜睡,乏力,反應(yīng)遲鈍等狀況。隨后精神極度沉郁,站立不穩(wěn),呼吸困難,全身抽搐后死亡。隨著時間延長其他組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)類似情況。各組小鼠死亡情況如表1所示。根據(jù)改良寇氏法算得:LD50=3.86 mg/kg;LD5095%的可信區(qū)間為3.82～3.90 mg/kg。

表1 急性毒性試驗小鼠死亡結(jié)果Tab.1 Results of mice died oin acute toxicity experiments

2.2 蓄積性毒性實驗結(jié)果

2.2.1 臨床觀察 對照組和Ⅰ組小鼠在試驗期間食欲正常,精神良好,個體增重迅速,未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;Ⅱ組和Ⅲ組小鼠在試驗初期,個別小鼠精神不佳,部分小鼠皮膚變得松弛,被毛凌亂,食欲減損,未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;Ⅳ組小鼠灌胃后也有不適現(xiàn)象,隨著染硒時間延長,出現(xiàn)食欲減損、行動遲緩、被毛凌亂,體重下降等狀況,并在第17 d,19 d分別死亡小鼠1只。各組體重變化情況如表2所示。

由表2知,試驗開始時,各組小鼠平均體重差異不顯著(P>0.05)。在試驗第7d,對照組與Ⅰ組、Ⅱ組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)。在試驗第14d,對照組與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05),Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間差異不顯著(P>0.05)。在試驗第21d,對照組與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著或極顯著(P<0.01)。

整個試驗階段所有組別小鼠平均體重都隨時間在一直增長,但不同染毒組隨染毒劑量增大及染毒時間的延長,平均體重增幅逐漸減小。在初始體重差別極小情況下,Ⅲ組、Ⅳ組小鼠在整個實驗階段體重增幅明顯低于對照組,說明對小鼠灌胃0.77 mg/kg和1.93 mg/kg劑量的硒有阻礙生長的作用。其原因可能是隨著硒攝入量的增加對小鼠產(chǎn)生毒性作用,干擾了小鼠正常生理代謝,故降低了體重增幅。此外,Ⅳ組小鼠在試驗期間出現(xiàn)死亡,可能也是引起該組小鼠平均體重增幅降低的原因之一[7]。

表2 各組小鼠平均體重的測定結(jié)果Tab.2 Average body weight(g)of different groups (單位:g)

2.2.2 病理剖解變化 剖檢中毒死亡小鼠發(fā)現(xiàn)其皮毛松弛,凌亂;心臟有不同程度的腫脹,胸腔出現(xiàn)充血;肝臟明顯腫大,色澤變黑,肝表面有明顯顆粒狀物質(zhì);腎臟出現(xiàn)腫大;脾臟出現(xiàn)腫大現(xiàn)象。死亡小鼠胃腸道肉眼觀察未見異常。

2.2.3 組織病理學(xué)變化 肝臟:Ⅰ組無明顯變化,Ⅱ組和Ⅲ組出現(xiàn)有顆粒變性以及輕微的間質(zhì)增寬現(xiàn)象,Ⅳ組出現(xiàn)細(xì)胞濁腫,胞漿疏松,有顆粒變性和空泡變性。脾臟:Ⅰ組未見有病變;Ⅱ組和Ⅲ組在脾髓內(nèi)充滿血液,紅髓的脾竇有充血現(xiàn)象;Ⅳ組脾髓充血,白髓縮小、出血。腎臟:Ⅰ、Ⅱ組腎臟都未見異常;Ⅲ組、Ⅳ組有腎小球體積增大,間質(zhì)小血管擴(kuò)張淤血,腎小管上皮細(xì)胞胞漿嗜酸性增強(qiáng),有顆粒變性等現(xiàn)象;心臟:第Ⅳ組心肌纖維部分腫脹,斷裂,有顆粒變性;其他組織鏡下未見異常變化。

2.2.4 臟器指數(shù)

本實驗的臟器指數(shù)如表3所示。

表3 不同硒水平對小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.3 Effect of selenium level on the mice viscera index

由表3知,心臟指數(shù):Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05),Ⅳ組與對照組差異顯著(P<0.05)。這與病理解剖觀察到死亡小鼠心臟腫大相一致,說明攝入高劑量硒會引起小鼠心臟腫大,胸腔充血[9]。肝臟指數(shù):Ⅰ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅱ組和Ⅲ組與對照組差異顯著(P<0.05),Ⅳ組與對照組差異極顯著(P<0.01)。這與病理解剖觀察到死亡小鼠肝臟腫大相一致[10-11]。脾臟指數(shù):Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組與對照組差異不顯著(P>0.05),Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05),Ⅳ組與對照組差異顯著(P<0.05),這與病理剖解觀察到死亡小鼠脾臟腫大相一致[12]。腎臟指數(shù):Ⅰ組與對照組差異不顯著(P>0.05);對照組與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。說明灌胃0.386 mg/kg硒時,可能會引起小鼠腎臟的損害,造成腎臟腫大。這與病理組織學(xué)觀察結(jié)果相一致。肺臟指數(shù):4個染硒組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 血常規(guī)檢測 本實驗的臟器指數(shù)如表4所示。

由表4知,對照組的各項血常規(guī)指標(biāo)與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組之間的 WBC、RBC、Hb、PCV、N、L 差異顯著(P<0.05),詳情見表4。

實驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(Hb)、血小板數(shù)(PL T)、紅細(xì)胞壓積(PCV)均顯著下降,可能是由于硒攝入過量后影響了骨髓造血機(jī)能,導(dǎo)致紅細(xì)胞生成減少,血小板生成障礙,以致血紅蛋白量、紅細(xì)胞壓積降低。實驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的白細(xì)胞數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞數(shù)(N)均不同程度下降,原因可能是脾臟發(fā)生病變引起。脾臟是體內(nèi)重要的免疫器官,與機(jī)體免疫功能關(guān)系密切。病理切片觀察紅髓內(nèi)細(xì)胞成分減少,白髓縮小,說明脾臟遭到損傷;白細(xì)胞又是體內(nèi)的免疫細(xì)胞,中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞總數(shù)中所占比例較大,隨著硒攝入量增加,對機(jī)體免疫功能產(chǎn)生一定抑制作用,造成二者數(shù)量都下降[11];實驗Ⅰ組的淋巴細(xì)胞(L)數(shù)量略高于對照組,而Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的顯著低于對照組,由于淋巴細(xì)胞數(shù)量直接反應(yīng)機(jī)體免疫功能高低,在實驗中的Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組淋巴細(xì)胞數(shù)量下降,說明隨著硒的攝入劑量增加,可能對小鼠的免疫系統(tǒng)功能產(chǎn)生了抑制作用。

2.2.6 血液生化指標(biāo)檢測 本試驗血液生化檢測指標(biāo)結(jié)果見表5。

表4 不同硒水平的小鼠血常規(guī)測定結(jié)果(n=5)Tab.4 Effect of selenium level on the mice viscera index at different group(n=5)

由表 5知,對照組的總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、A/G值與第Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),而對照組的 TP、ALB、A/G值與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01),各組的球蛋白(GLO)都差異不顯著(P>0.05)。第Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的 TP、ALB、A/G值都不同程度降低,可能是硒攝入過量后對肝臟造成損傷,使肝臟合成蛋白質(zhì)的能力下降,導(dǎo)致總蛋白和血清蛋白含量降低,A/G值下降也提示動物肝功能可能受損。這與病理組織觀察到Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組肝臟病變相一致。對照組的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AL T)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(A KP)均與Ⅰ組差異不顯著(P>0.05),與Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的AST、AL T、A KP活性與對照組差異顯著或極顯著,可能是小鼠肝細(xì)胞變性壞死后,AST、ATL、A KP從受損的肝細(xì)胞中大量逸出,造成其在血清中活性明顯升高;正常情況下血清中AST活性很低,心臟的活性很高,當(dāng)硒攝入過量引起心肌纖維斷裂,細(xì)胞膜通透性增高,AST大量釋放入血,可能也是造成血清中活性明顯升高的原因;當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞受損也可釋放A KP,導(dǎo)致血清A KP活性升高。LDH也可作為判斷心臟或肝臟發(fā)生病變的指標(biāo)。LDH增高可能是隨著攝入硒的劑量增加對小鼠肝臟造成損壞而引起,也可能是由于小鼠心臟腫大受損而引起。這與解剖學(xué)及組織病理學(xué)觀察到肝臟、腎臟、心臟發(fā)生病變相一致。各組的甲胎蛋白和癌胚抗原都呈陰性,說明各組小鼠的肝臟都未發(fā)生致癌變化。

3 結(jié) 語

1)由急性毒性實驗所得小鼠經(jīng)口LD50為3.86 mg/kg,按中國毒理學(xué)經(jīng)口急性毒性評判標(biāo)準(zhǔn)為劇毒物質(zhì),小鼠發(fā)生急性硒中毒的主要靶器官是肝臟和心臟。但由于低劑量的硒對動物生長有促進(jìn)作用,因此在保健食品中添加亞硒酸鈉時務(wù)必控制其用量,避免人體發(fā)生急性中毒。

2)蓄積性毒性實驗表明亞硒酸鈉屬于弱蓄積性物質(zhì),小鼠發(fā)生硒蓄積性中毒的主要靶器官是肝臟、心臟、脾臟和腎臟。當(dāng)染硒劑量為0.39、0.77、1.93 mg/kg時,3個組小鼠體質(zhì)量增長緩慢,生長發(fā)育受阻。隨染硒劑量的增高,小鼠生長受阻現(xiàn)象越嚴(yán)重。當(dāng)染硒劑量為0.19 mg/kg時,對小鼠有一定促生長作用,即低劑量的硒有助于動物生長發(fā)育[13-14]。

硒雖然是人不可缺少的微量元素,但不能攝入過量,否則會對機(jī)體帶來急性和蓄積性損害作用。在補(bǔ)硒食品的生產(chǎn)過程中,為了保障人們食品安全,不應(yīng)盲目增加食品中硒的添加劑量,硒的添加劑量要控制在人體的安全攝入量范圍之內(nèi),要保證高硒地區(qū)不致發(fā)生硒中毒,低硒或缺硒地區(qū)居民滿足生理和最低需要量。

[1]Brown KM,Arthur JR.Selenium,selenoproteins and human health:a review[J].Public Health Nutr,2001,4:593-599.

[2]Combers GF.Status of selenium in prostate cancer prevention[J].Br J Cancer,2004,91(2):195-199.

[3]倪靜安.微量元素硒、自由基與健康的關(guān)系[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1992,11(03):274-279.LI Jin-an.The relations of free radical and trace selenium about health[J].Journal of Wuxi University of Light Industry,1992,11(03):274-279.(in Chinese)

[4]杜瑩,劉曉.微量元素硒的研究進(jìn)展[J].微量元素與健康研究,2007,24(3):56-58.DU Ying,LIU Xiao.The advanced research of trace selenium[J].Studies of Trace Elements and Health,2007,24(3):56-58.(in Chinese)

[5]Food and Nutrition Board.Dietary Reference Intakes for Vitamin C,vitamin E,Selenium,and Carotenoids[M].Washington,DC:National Academy Press,2000.284-324.

[6]李建科.食品毒理學(xué)[M],北京:中國計量出版社,2008:122-149.

[7]王建華.硒對動物的毒性作用研究進(jìn)展[J].國外獸醫(yī)學(xué)-畜禽疾病,1994,5,15(2):9-14.WANGJian-hua.The advanced research of toxicity about selenium to animal[J].Veterinary science of Overseas-Poultry Disease,1994,5,15(2):9-14.(in Chinese)

[8]賀建忠.硒中毒的研究進(jìn)展[J].飼料研究,2007,6:37-38,48.HUO Jian-zhong,The advanced research of toxicityabout selenium[J].Feed Research,2007,6:37-38,48.(in Chinese)

[9]盧建華,施榮鑫.硒中毒的各種原因和各種表現(xiàn)[J].國外畜牧學(xué).豬與禽,2001,(06):26-27.LU Jian-hua,Si Rong-xing.Many kinds of reasons and manifestation about toxicityabout selenium[J].Feed International,Pigs and Poultry,2001,(06):26-27.(in Chinese)

[10]Neve J.Selenium as a risk factor for cardiovascular diseases[J].Cardiovasc Risk,1996,3(1):42-47.

[11]Hatfield DL,ed.Selenium:its molecular biology and role in human health.,MA:Kluwer Academic,2001.

[12]龔偉,王哲.硒對免疫功能影響的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,1998,19(4):16-18.GONG Wei,WANG Ze.The advanced research of selenium to immunologic function[J].Progress in Veterinary Medicine,1998,19(4):16-18.(in Chinese)

[13]金虹.微量元素硒與人畜健康[J].青海大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,4,22(2):80-83.J ING Hong.The trace selenium element for human and livestock health[J].Journal of Qinghai University,2004,4,22(2):80-83.(in Chinese)

[14]張寶弟,郭雄.硒和硒化合物[J].國外醫(yī)學(xué):醫(yī)學(xué)地理分冊,2004,25(2):58-61.ZHANGBao-Di.Selenium and Compound of selenium[J].Foreign Medical Sciences:Section of Medgeography,2004,25(2):58-61.(in Chinese)