范順太 李 平 王金蘭 婁季宇 白宏英 陳江波

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 鄭州 450014

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指原發(fā)性非 外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血,占急性腦血管病的20%～30%,發(fā)病率為(60～80)人/(10萬?年),急性期病死率30%～40%。已有多項研究證實細胞凋亡是腦出血的繼發(fā)性損傷機制之一。糖尿病是最嚴(yán)重的全球性問題之一,糖尿病能增加腦出血患者早期的死亡風(fēng)險[1],同時也是其預(yù)后不良的因素[2]。本實驗通過建立高血糖腦出血模型,采用免疫組化和TUNEL法研究高血糖對大鼠腦血腫周圍組織神經(jīng)細胞凋亡和Bax的表達的影響,為高血糖腦出血的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 成年雄性SD大鼠96只,體質(zhì)量200～250 g,由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。按照隨機化原則將實驗動物分為4組:假手術(shù)組、正常血糖組、高血糖組以及胰島素干預(yù)組。每組設(shè)4個時間點:6 h、24 h、72 h、7 d,每個時間點設(shè)6只大鼠。

1.2 主要儀器及試劑 江灣Ⅱ型立體定位儀、微量進樣器、顯微外科手術(shù)器械、牙科鉆、羅氏血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、SP系列二抗、DBA顯色液(均購北京中杉生物技術(shù)有限公司)、TUNEL試劑盒(Sigema公司);Streptozotocin(STZ)(Sigema公司);普通胰島素,每瓶400U(10m l)(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 高血糖模型大鼠的建立 參照STZ誘導(dǎo)法制備高血糖大鼠模型[1],以STZ 60mg/kg,對高血糖及胰島素干預(yù)組大鼠單次腹腔注射,注射后1周檢測血糖≥11.1 mmol/L為成功模型。

1.4 大鼠尾狀核腦出血模型、高血糖模型的建立 高血糖模型[3]成功后,胰島素干預(yù)組腹壁皮下注射普通胰島素,3次/d,4 U/次,將血糖控制在8.3 mmol/L以下,直至實驗結(jié)束。注射參照Xue等[4]的方法,大鼠用 10%的水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于立體定向儀,行頂部正中切口,調(diào)整立體定向儀使大鼠前囟和后囟在同一水平面,于前囟前0.2 mm,中線向右旁開3.0 mm處進針,深度5mm,即尾狀核位置。假手術(shù)組緩慢注入50μl滅菌生理鹽水,其余各組緩慢注入50μl自體動脈血,動脈血采自股動脈,15 m in注射完畢,留針10 m in后緩慢緩慢退出,縫合皮膚。

1.5 標(biāo)本及病理切片的制作 將各組大鼠在相應(yīng)的時間點用過量的水合氯醛麻醉,迅速打開胸腔,經(jīng)左心室插管,同時剪開右心耳,快速灌注滅菌生理鹽水,直至由右心耳流出的液體變?yōu)榍辶翞橹?繼而灌注4%的多聚甲醛液200m l,然后斷頭取腦,腦組織標(biāo)本浸入4%的多聚甲醛液后固定48 h,以注射點為中心取厚約1 cm的冠狀切片,石蠟包埋。冠狀位上連續(xù)切片,片厚4μm,分別行免疫組化和TUNEL染色。1.6 圖像采集分析 光學(xué)顯微鏡下,DBA染色陽性細胞染色呈棕黃色,利用德國Leica顯微成像系統(tǒng)和上海山富科學(xué)有限公司Biosens Digital Imaging System圖像分析軟件,計算每組大鼠血腫周圍 Bax陽性細胞的平均積分光密度。TUNEL結(jié)果計算:凋亡陽性細胞的細胞核呈棕黃色,細胞出現(xiàn)黃至棕黃褐色顆粒。在裝有目鏡網(wǎng)格測微尺的400倍視野下隨機計數(shù)血腫周圍4個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)及神經(jīng)細胞,計算凋亡指數(shù)(凋亡細胞數(shù)/神經(jīng)細胞×100%)。

2 結(jié)果

2.1 腦血腫周圍組織Bax表達情況 假手術(shù)組、正常血糖組、高血糖組及胰島素干預(yù)組的腦血腫周圍組織均有Bax的表達,6 h開始逐漸增多,24 h達高峰,7 d仍有表達;高血糖組各時間點的表達水平均高于其他各組(P＜0.01);胰島素干預(yù)組與正常血糖組的Bax的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),假手術(shù)組相應(yīng)部位也有少量Bax的表達。均數(shù)間的兩兩比較,胰島素干預(yù)組與正常血糖組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),余差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 4組各時間點血腫周圍Bax陽性細胞的平均積分光密度的變化 (±s)

表1 4組各時間點血腫周圍Bax陽性細胞的平均積分光密度的變化 (±s)

注:與假手術(shù)組相比,○P＜0.01;與正常血糖組相比,▲P＜0.01;與高血糖組相比,●P＜0.01

?

2.2 原位末端標(biāo)記(TUNEL)法染色結(jié)果 在光鏡下觀察,細胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞,假手術(shù)組、正常血糖組、高血糖組及胰島素干預(yù)組凋亡細胞主要分布血腫周邊區(qū),6 h開始逐漸增高,24 h達高峰,7 d仍有凋亡細胞;高血糖組各時間點的凋亡細胞數(shù)均高于其他各組(P＜0.01),胰島素干預(yù)組與正常血糖組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),假手術(shù)組的凋亡細胞數(shù)最低;凋亡細胞數(shù)間的兩兩比較,胰島素干預(yù)組與正常血糖組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞ 0.01),余差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 4組各時間點血腫周圍神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的變化 (±s,%)

表2 4組各時間點血腫周圍神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)的變化 (±s,%)

注:與假手術(shù)組相比,○P＜0.01;與正常血糖組相比,▲P＜0.01;與高血糖組相比,●P＜0.01

?

2.3 血腫周圍細胞凋亡與Bax表達的相關(guān)性 凋亡指數(shù)與同一時間點的Bax表達呈正相關(guān)(r=0.80,P＜0.01)。見表3。

表3 高血糖組各時間點Bax的表達與凋亡指數(shù) (±s)

表3 高血糖組各時間點Bax的表達與凋亡指數(shù) (±s)

注:凋亡指數(shù)與同一時間點的Bax表達呈正相關(guān),r=0.80,P＜0.01

?

3 討論

凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細胞死亡過程,也稱為程序性細胞死亡(p rogrammed cell death)的表現(xiàn)形式,在組織的正常發(fā)育、細胞的正常更新、細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、病理紊亂以及腫瘤退化中起重要作用[5]。W ang等[6]發(fā)現(xiàn)糖尿病會促使大腦局部缺血現(xiàn)象的惡化,引發(fā)神經(jīng)細胞的大量凋亡。業(yè)已證實凋亡可能參與了大鼠血腫周圍腦組織損傷的病理生理過程[7-8]。高血糖存在導(dǎo)致大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)細胞凋亡增加的可能。

Bax是Bcl-2家族中最具促凋亡特征的基因,基因產(chǎn)物蛋白由192個氨基酸組成,分子量為21 U,基因長4.5 kb[9]。Bax分布于線粒體外膜上,與線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP,本質(zhì)是一種蛋白復(fù)合物)結(jié)合,導(dǎo)致膜去極化引起跨膜電位的改變。正常情況下,絕大多數(shù)PTP處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)線粒體跨膜電位降低時,PTP開放,導(dǎo)致線粒體膜通透性增大,使細胞凋亡的啟動因子,如細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等從線粒體內(nèi)釋放出來。細胞色素C與Apaf相互作用可激活caspase-9,而AIF可快速激活核酸內(nèi)切酶,并增強caspase-3的水解活性[10]。

本研究結(jié)果表明,在高血糖組大鼠血腫周圍腦組織中6 h已有Bax表達,隨之逐漸升高,24 h達高峰,繼而開始下降,7 d時仍有表達,各時間點與其他各組比較均有顯著差異。胰島素干預(yù)組與正常血糖組的Bax的表達無明顯差別。用TUNEL法染色研究發(fā)現(xiàn),高血糖組大鼠血腫周圍腦組織6 h已存在凋亡細胞,隨之逐漸增多,24 h達高峰。胰島素干預(yù)組與正常血糖組的細胞凋亡無明顯差別。高血糖組與同一時間點Bax的表達具有相關(guān)性。以上結(jié)果表明了高血糖能增加大鼠腦血腫周圍組織神經(jīng)細胞凋亡和Bax的表達。其機制可能是高血糖使乳酸生成增多而直接導(dǎo)致腦損傷,同時使ATP生成減少,引起細胞能量耗竭;高血糖時可以產(chǎn)生大量的興奮性氨基酸、羥自由基、糖化血紅蛋白而導(dǎo)致腦損傷;高血糖時可以破壞血腦屏障而加重腦水腫;高血糖可以增強NO的毒性作用,促進亞硝酸鹽的形成,加重神經(jīng)元損傷;高血糖可以造成低鈣血癥和低鎂血癥,進而干擾線粒體磷酸化過程,加重腦水腫。胰島素干預(yù)組各時間點的凋亡細胞指數(shù)和Bax表達均與正常血糖組無明顯差別,提示合理控制血糖水平能減少Bax的表達和抑制腦細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述,高血糖能增加大鼠腦血腫周圍組織神經(jīng)細胞凋亡和Bax的表達,通過合理控制血糖水平能減少Bax的表達和抑制腦細胞凋亡的發(fā)生,減輕腦出血的繼發(fā)性病理損害,從而為高血糖腦出血患者的治療探索道路。

[1] Kimura K,IguchiY,Inoue T,et al.Hyperglycem ia independently increases the risk of early death in acute spontaneous intracereb ral hemo rrhage[J].J Neurol Sci,2007,263(1/2): 228-229.

[2] Passero S,Ciacci G,U livelli M.The influence of diabetes and hypergly cem ia on clinical courseafter intracerebralhemorrhage [J].Neurology,2003,61(10):1 351-1 356.

[3] 李聰然,游雪甫,蔣建東.糖尿病動物模型及研究進展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2005,15:59-63.

[4] Xue Mengzhou,Mare R,Del Bigio.Intracerebral injection of autologousw holeb lood in rats:time courseof inflammation and death[J].Neu roscience Letters,2000,283(3):230-232.

[5] K roemer G,Galluzzi L,B renner C.M itochondrialmembrane permeabilization in cell death[J].Physiol Rev,2007,87(1): 99.

[6] Bederson JB,Pitts LH,TsujiM,et al.Ratm iddle cereb ral artery occusion:evaluation of the model and developmen t of a neu rologic exam ination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[7] 李建設(shè),白宏英,王金蘭.大鼠腦出血后Bax表達與神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)系及氟桂利嗪的干預(yù)作用[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2009,12(3):35-38.

[8] Delgado P,Cuad rado E,RosellA,et al.Fas system activation in perihematom al areas after spontaneous in tracereb ral hem orrhage[J].Stroke,2008,39(6):1730-1734.

[9] O ltvai ZN,M Illiaman CL,Korsm cyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo w ith a conserved homolog,Bax,thataccelerates cell death[J].Cell,1993,74(4):609-619.

[10] 金惠銘主編.病理生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004: 137.