慢性腦缺血(chronic cerebra l ischemia,CCI)與臨床諸多腦血管疾病密切相關(guān)。慢性腦缺血時,少突膠質(zhì)細(xì)胞存在易損性,而星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生、氧化應(yīng)激和興奮性毒性等是造成上述情況的重要原因。目前,有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物EGb761(G inkgo biloba ex tract 761)在腦缺血時對神經(jīng)元保護(hù)作用的研究較多,而針對其對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抗腦缺血作用的研究相對較少。本試驗(yàn)通過對慢性腦缺血大鼠模型給予國際標(biāo)準(zhǔn)含量的銀杏葉提取物EGb761進(jìn)行干預(yù),觀察其對少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響,為慢性腦缺血的預(yù)防和治療開辟新思路,提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組:雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量(220±30) g,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分成3組:A組為假手術(shù)組,B組為單純?nèi)毖M,C組為EGb761干預(yù)組,每組10只。

1.1.2 藥物與試劑:EGb761(達(dá)納康,按國際標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物要求選取,內(nèi)含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯, 40mg/粒),由法國博福-益普生制藥工業(yè)公司生產(chǎn);GFAP抗體(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白抗體)、CNPase抗體(2'3'-環(huán)核苷酸3'-磷酸二酯酶抗體),均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCI模型鼠的制備:參考Wakita等[1]方法制備動物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉后,頸部備皮、消毒,頸正中切開皮膚,切口1.5～2.0 cm,鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌,分離出雙側(cè)頸總動脈,每側(cè)用雙線分別在近心端和遠(yuǎn)心端結(jié)扎,然后在兩結(jié)扎處之間剪斷頸總動脈制備出單純?nèi)毖M和干預(yù)組模型,假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎,縫合切口,對皮并消毒,放回原環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法:將達(dá)納康研成粉末狀,用蒸餾水溶解并混勻,術(shù)后24 h按照0.5 m l/100 g予灌胃,單純?nèi)毖M給予等量蒸餾水灌胃,各組灌胃均為1次/d,持續(xù)12周。

1.2.3 標(biāo)本的收集與處理:大鼠經(jīng)麻醉后,常規(guī)生理鹽水及4%多聚甲醛灌注、固定,斷頭取腦,制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm),分別采用H E染色和免疫組化染色,檢測腦組織病理變化和皮層、胼胝體及海馬GEAP、CNPase陽性細(xì)胞數(shù)的情況。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色) 假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化;單純?nèi)毖M可見神經(jīng)元大量變性、壞死,胞體呈三角形,胞漿致密,周圍出現(xiàn)空暈,白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在的神經(jīng)纖維及髓鞘潰變,表明腦組織有明顯的缺血及腦白質(zhì)受損表現(xiàn); EGb761組神經(jīng)元變性壞死及腦白質(zhì)受損均較單純?nèi)毖M減輕。

2.2 大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞CNPase及GFAP的變化情況

2.2.1 CNPase變化情況:各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)CNPase陽性細(xì)胞個數(shù)。單純?nèi)毖MCNPase陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于假手術(shù)組和EGb761組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬CNPase陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,個/400倍)

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬CNPase陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,個/400倍)

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2.2.2 GFAP變化情況:各組均取皮層、胼胝體、海馬處進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。單純?nèi)毖MGFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于假手術(shù)組和EGb761組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2 大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,個/400倍)

表2 大鼠皮層、胼胝體、海馬GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)情況(±s,個/400倍)

注:干預(yù)組與單純?nèi)毖M比較,◆P＜0.01;單純?nèi)毖M與假手術(shù)組比較,*P＜0.01

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3 討論

少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte,OLG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞,在發(fā)生缺血缺氧性損傷后對神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在數(shù)目占絕對優(yōu)勢的一類膠質(zhì)細(xì)胞,被認(rèn)為在神經(jīng)元的整個發(fā)育過程中起重要作用[2],它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié),在維持神經(jīng)元的生存微環(huán)境中起著重要的作用。缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì),對缺血損傷神經(jīng)元具有保護(hù)作用;而過度增生可作為機(jī)械屏障影響髓鞘和軸索的再生,從而影響周圍神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)。國際標(biāo)準(zhǔn)EGb761,含24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內(nèi)酯等多種活性物質(zhì),現(xiàn)已證實(shí), EGb中銀杏黃酮為自由基清除劑,銀杏內(nèi)酯為特異性PAF受體阻滯藥,對缺血時的神經(jīng)元有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用CNPase、GFAP分別標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,應(yīng)用EGb761對慢性腦缺血大鼠灌胃治療,觀察大鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。

OLG對缺血性損傷高度敏感性的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸和凋亡通路激活等[3]。(1)OLG中鐵含量高,而谷胱甘肽含量卻較低,清除自由基能力弱而且顯著依賴于氧化磷酸化,因此容易受到氧化應(yīng)激損傷[4]。另外,膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更易發(fā)生鐵和鋁的蓄積,加重氧化應(yīng)激。許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)EGb761能夠清除自由基。EGb761通過抑制細(xì)胞氧自由基的釋放削弱超氧自由基對少突膠質(zhì)細(xì)胞的攻擊,同時增強(qiáng)細(xì)胞抗缺氧能力。(2)OLG表達(dá)功能性谷氨酸的非NMDA受體,包括紅藻氨酸受體和AMPA受體,故其對興奮性氨基酸易感[5]。且OLG缺氧缺血時產(chǎn)生興奮性損傷,胞內(nèi)Na+的濃度急劇增高,局部谷氨酸濃度顯著增加使AMPA、Kainate受體過度活化,從而介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。EGb761可抑制非競爭性NMDA受體,又能作用于谷氨酸受體活化水平,抑制受體活化后引起的一系列級聯(lián)活化和離子通道的開放,從而對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性和Ca2+超載對細(xì)胞的損傷。(3)OLG含有豐富的神經(jīng)鞘磷脂和酞基鞘氨醇,這兩種化合物在體外試驗(yàn)中均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。在利用黃嘌呤誘發(fā)PC12細(xì)胞凋亡模型,Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯能削弱由黃嘌呤誘導(dǎo)的p53、c-M yc、Bax和Caspase-3蛋白酶等多種重要凋亡因子的表達(dá),直接證實(shí)銀杏內(nèi)酯可拮抗細(xì)胞凋亡,并可在凋亡早期阻斷其進(jìn)程。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,EGb761干預(yù)組腦組織中的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較單純?nèi)毖M明顯增加(P＜0.01),提示EGb761的確能夠減輕OLG在慢性腦缺血時的損傷。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦損傷后增生并產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)反過來又可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和功能障礙。它們包括谷氨酸、鉀、乳酸、花生四烯酸、NO和Ca2+流量變化等。所有這些因子都能影響星形膠質(zhì)細(xì)胞,而星形膠質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)生障礙則可影響神經(jīng)元存活[8]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在一定程度上反映了腦缺血缺氧的程度。EGb761能夠針對反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的多種損傷機(jī)制進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況較單純?nèi)毖M明顯改善(P＜0.01),提示EGb761能抑制腦缺血時星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)。

腦損傷的病理生理改變存在諸多環(huán)節(jié),如氧自由基、Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性作用和生物膜損傷等,只要針對其中某一環(huán)節(jié)施加干預(yù)都將打斷級聯(lián)反應(yīng)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。EGb761作用的多重性與慢性腦缺血中的病理生理反應(yīng)多樣性相對應(yīng),從而對慢性缺血的腦起保護(hù)作用。由于慢性腦缺血所致腦損傷除了氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化和興奮性毒性外,還涉及其他因素,盡管EGb761確實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用,但其保護(hù)OLG缺血性損傷及抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的確切機(jī)制仍需深入研究。

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