范熠 唐宇 高燕

類鐸受體（Toll-like receptors，TLRs）是近年來發(fā)現(xiàn)的模式識別分子，在誘導免疫應答中具有非常重要的作用。胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸-脫氧寡核苷酸（cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotides，CpG ODN）是TLR9的激動劑，它能夠有效地增強機體的免疫功能，從而成為研究熱點。CpG能夠激活多種天然免疫細胞抑制細菌、病毒和寄生蟲等病原體的感染和增強機體的抗腫瘤效應[1]。通過激活肝臟內(nèi)的巨噬細胞-枯否細胞（Kupffer cells，KC）功能，CpG 能夠抑制某些肝臟疾病的發(fā)生[2]，抑制腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[3]。然而，CpG抑制肝癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移的具體機制尚不清楚。研究已證實，乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）是導致肝癌惡化的多功能病毒調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。因此，本研究對CpG是否通過KC細胞干擾HBx信號轉(zhuǎn)導進行了初步研究。

材料與方法

一、動物、質(zhì)粒和細胞株 雄性BABL/c小鼠，8～12周齡，由本校動物中心提供。重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO-HBx和空質(zhì)粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO及人肝母細胞瘤HepG2細胞均由本室保存。

二、主要試劑 TLR9激動劑CpG ODN1826、對照ODN1826 Control和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual Luciferase Reporter Gene Assay）購自美國Promega公司；鼠抗人β-actin抗體和抗HBx抗體均購自美國Santa公司；Ⅳ型膠原酶、鏈霉蛋白酶E和Percoll細胞分離液均購自美國Sigma公司；FITC anti-mouse F4/80抗體購自美國Ebioscience公司；檢測小鼠干擾素-α、γ（mouse IFN-α、γ）ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

三、KC細胞的分離與鑒定 根據(jù)嚴茂林等[4]報告的兩步灌注法，應用0.05%Ⅳ型膠原酶和鏈霉蛋白酶E溶液對BALB/c小鼠肝臟進行原位灌注，將獲得的細胞懸液用35%～65%Percoll細胞分離液進行雙層密度梯度離心。分離的KC細胞經(jīng)貼壁培養(yǎng)1h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后用0.25%胰酶消化，收集KC細胞。將KC細胞與FITC anti-mouse F4/80抗體冰浴30min，進行流式細胞術（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測，以分析細胞的純度。

四、轉(zhuǎn)染HepG2細胞HBx蛋白表達的檢測 采用Western blotting法，分別取1×107個重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO-HBx和空質(zhì)粒pcDNA3.1D/V5-HIS-TOPO轉(zhuǎn)染HepG2細胞，12%SDS-PAGE電泳，取下凝膠，將蛋白質(zhì)在100V轉(zhuǎn)印1h至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），再將該PVDF膜用5%脫脂奶粉-吐溫封閉過夜，PBS-T漂洗，加入用5%脫脂奶粉稀釋的鼠抗人 β-actin抗體和抗 HBx抗體（1：1000），在室溫下孵育2h，PBS-T洗膜3次，加入5%脫脂奶粉稀釋并與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG（1：5000）孵育，室溫輕搖2h，PBS-T洗膜3次，DAB避光顯色5min，攝像。

五、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞酶活性檢測 轉(zhuǎn)染前1d，取對數(shù)生長期HepG2細胞鋪24孔板，每孔500μl DMEM完全培養(yǎng)基含1.5×105個細胞，次日，細胞生長融合度達95%。轉(zhuǎn)染前更換為無血清的培養(yǎng)基待用，轉(zhuǎn)染時按LipofectiamineTM 2000試劑盒要求分別進行HBx表達質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞用無抗生素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基500μl。在HBx轉(zhuǎn)染HepG2細胞孔中加入1×106個KC細胞，設不加細胞對照，再分別加入TLR9激動劑CpG ODN1826或?qū)φ誒DN1826 Control，使其終濃度為10μM。繼續(xù)培養(yǎng)12h后收集上清液待用，貼壁細胞用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒處理，分別測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性值，并計算酶的相對活性。細胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性檢測重復3次，每次均設置復孔。

六、培養(yǎng)上清液干擾素的檢測 將培養(yǎng)上清液進行離心，取50μl上清液，采用ELISA法分別檢測干擾素-α和γ。以IgG標準品濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），吸光度（A值）為縱坐標繪制標準曲線，查找被檢樣品的相應濃度。每次設置復孔，干擾素的檢測重復3次，取平均值。

七、統(tǒng)計學分析 雙熒光素酶檢測結(jié)果以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2的結(jié)果為參照，對各組數(shù)據(jù)進行標準化處理并計算出相對比值。應用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，P<0.05被認為具有顯著性差異。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染HepG2細胞HBx蛋白的表達 檢測發(fā)現(xiàn)重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞能夠表達HBx蛋白，分子量為17kD，與預期相符，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞不表達HBx蛋白，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染HepG2細胞中HBx蛋白的表達

二、KC細胞的鑒定 成功分離的KC細胞經(jīng)培養(yǎng)24h后，細胞形態(tài)較好，均伸展成梭形或不規(guī)則形，見圖2。

圖2 KC細胞的形態(tài)學表現(xiàn)

用熒光抗F4/80標記后進行流式細胞術分析，發(fā)現(xiàn)其純度為83.6%，見圖3。臺盼藍染色顯示細胞活力＞95%。

三、轉(zhuǎn)染HepG2細胞HBx轉(zhuǎn)導NF-κB信號的變化

在HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細胞培養(yǎng)體系中加入KC細胞和TLR9激動劑進行共培養(yǎng)，采用雙熒光素酶試劑盒檢測HBx介導的NF-κB信號通路的活化狀況，以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為對照進行標準化處理。結(jié)果顯示，與HBx轉(zhuǎn)染組（4.83±0.56）比，加入 KC細胞和 TLR9激動劑后雙熒光素酶的相對活性顯著下降（3.14±0.85，P＜0.05），約為HBx轉(zhuǎn)染組的65%；而加入KC細胞和TLR9激動劑對照對NF-κB信號通路的活化無顯著性影響（4.69±0.52，P＞0.05），見圖 4。

圖4 HBx介導的NF-κB信號活性比較

圖3 流式細胞術檢測KC細胞純度

四、KC細胞依賴的轉(zhuǎn)染HepG2細胞HBx介導的NF-κB信號變化 進一步對抑制HBx介導NF-κB信號活性的KC細胞進行劑量依賴性分析。在HBx轉(zhuǎn)染的 HepG2 細胞培養(yǎng)液中分別加入 1×105、1×106和1×107個KC細胞，孵育后進行雙熒光素酶分析，結(jié)果顯示加入不同數(shù)量的KC細胞后NF-κB信號活性存在顯著性差異（P＜0.05），即隨著KC細胞數(shù)量的增加，雙熒光素酶的相對活性逐漸下降，見圖5。

圖5 不同數(shù)量的KC細胞對轉(zhuǎn)染HepG2細胞HBx信號轉(zhuǎn)導的影響

五、共培養(yǎng)體系上清液干擾素水平的變化 在HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細胞與枯否細胞和TLR9激動劑共培養(yǎng)12h，與HBx轉(zhuǎn)染組比，加入枯否細胞和TLR9激動劑后IFN-α和IFN-γ水平分別增加了8.7倍和6.5倍（P<0.05），而加入枯否細胞和TLR9激動劑Control則對IFN-α和IFN-γ的產(chǎn)生無顯著性影響，見圖6。

圖6 共培養(yǎng)體系上清IFN-α和IFN-γ水平的變化比較

討 論

HBV感染和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生有關。HBV感染者發(fā)生HCC的危險性是無感染者的200多倍[5]。HBx基因是HBV復制所必需的基因，在乙型肝炎慢性化和HCC的發(fā)生中具有重要的作用。HBx蛋白是一種反式激活因子，其本身不能與雙鏈DNA直接結(jié)合，而是通過調(diào)控基因表達和蛋白間相互作用，激活多條細胞信號轉(zhuǎn)導通路，如HIF-1α、NF-κB、AP-1、SP1 和 oct-1 等多種核轉(zhuǎn)錄因子，影響細胞的增殖、分化和凋亡，促進其惡性轉(zhuǎn)化[6]。因此，干擾HBx蛋白信號轉(zhuǎn)導功能對防治HBV相關性肝癌的發(fā)生具有重要意義。

TLRs受體是近年來發(fā)現(xiàn)的重要模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），是介導天然免疫與適應性免疫的橋梁[7]。CpG能夠激活TLR9信號通路，并誘導機體產(chǎn)生抗病原體感染和抑制腫瘤細胞增殖等多種免疫效應[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CpG對HCC的增殖與轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用[2]，但CpG具體的作用機制尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示，當CpG作用于KC細胞后，能夠顯著地抑制HBx蛋白介導的NF-κB信號通路的活化。KC細胞是肝臟內(nèi)最重要的免疫細胞，是組織巨噬細胞中最大的群體。CpG激活KC細胞能夠產(chǎn)生多種細胞因子，如干擾素、白介素12（IL-12）和腫瘤壞死因子（TNF-α）等[9]。其中，IFN 是抑制病毒感染的重要效應分子。本研究發(fā)現(xiàn)CpG激活KC細胞能夠誘導IFN-α和IFN-γ的大量分泌，后者可能干擾了HBx信號的轉(zhuǎn)導，最終影響到肝臟腫瘤細胞的增殖與惡化。

Van等研究發(fā)現(xiàn)，KC細胞在抑制肝臟腫瘤方面具有潛在的利用價值，CpG能夠激活KC細胞，誘導產(chǎn)生大量的IFN-α等效應分子，從而在肝臟局部產(chǎn)生高濃度的IFN-α微環(huán)境，顯著抑制HBx蛋白介導的多種信號通路的活化[10，11]，與本研究結(jié)果相符。因此，本研究為通過阻斷HBx信號轉(zhuǎn)導途徑治療肝癌提供了實驗依據(jù)。

[1]楊光，楊亮，包木勝，等.新型CpGODN對乙型肝炎病毒復制的抑制作用[J].中國免疫學雜志，2009，（7）：60-63.

[2]CHEN J，XU W，ZHOU T，et al.Inhibitory role of tolllike receptors agonists in Plasmodium yoelii liver stage development[J].Parasite Immunol，2009，31（8）：466-473.

[3]BERTIN S，ANJUERE F，GAVELLI A，et al.Plasmidic CpG sequences induce tumor microenvironment modifications in a rat liver metastasis model[J].Int J Mol Med，2008，21（3）：309-315.

[4]嚴茂林，王耀東，田毅峰，等.小鼠肝Kupffer細胞分離方法探討[J]. 福建醫(yī)科大學學報，2008，42（6）：526-528.

[5]王郁杰.pCMV-tag2B—HBX質(zhì)粒的構建和表達[J].內(nèi)科，2008，3（3）：326-328.

[6]孫長宇，張賢強，楊觀瑞，等.HBX蛋白、骨橋蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9在肝細胞癌組織中的表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2008，48（48）：6-8.

[7]董寧，姚詠明.Toll樣受體免疫學研究新進展[J].感染炎癥修復，2008，9（3）：34-36.

[8]SHARMA S，DOMINGGUEZ AL，MANRIQUE SZ，et al.Systemic targeting of CpG-ODN to the tumor microenvironment with anti-neu-CpG hybrid molecule and T regulatory cell depletion induces memory responses in BALB-neuT tolerant mice[J].Cancer Res，2008，68（18）：7530-7540.

[9]KAWABATA T，KINOSHITA M，INATSU A，et al.Functional alterations of liver innate immunity of mice with aging in response to CpG-oligodeoxynucleotide[J].Hepatology，2008，48（5）：1586-1597.

[10]VAN DER BIJ GJ，OOSTERLING SJ，MEIJER S，et al.Therapeutic potential of Kupffer cells in prevention of liver metastases outgrowth[J].Immunobiology，2005，210（2-4）：259-265.

[11]OHATA K，ICHIKAWA T，NAKAO K，et al.Interferon alpha inhibits the nuclear factor kappa B activation triggered by X gene product of hepatitis B virus in human hepatoma cells[J].FEBS Lett，2003，553（3）：304-308.