牛宗亮,王榮鎮(zhèn),董新偉,郭承華

(煙臺大學(xué) 化學(xué)生物理工學(xué)院,山東 煙臺 264005)

海膽是一種低等的海洋無脊椎動物,屬于棘皮動物門(Echinodermata) 海膽綱(Echinoidea)。中國黃渤海海域常見的海膽有 5種,包括馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)、紫海膽(Anthocidaris crassispina)、海刺猬(Glyptocidaris crenularis)、中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)和光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)[1]。目前,國內(nèi)外對海膽資源利用不夠充分,綜合開發(fā)利用水平較低。對海膽資源一般局限于其生長習(xí)性、基因的結(jié)構(gòu)、規(guī)律、功能、物種系統(tǒng)進(jìn)化、受精卵的發(fā)育以及海膽用于食品保健等方面的研究[2~5],但對其活性物質(zhì)研究較少。Murata 等[1]使用反相高效液相色譜測定了馬糞海膽的一種氨基酸—pulcherrimine; 美國學(xué)者Biermann[6]對海洋模式生物—光棘球海膽種系發(fā)生和進(jìn)化的進(jìn)行了深入的研究; 韓國學(xué)者 Youn-Ho Lee[7]對光棘球海膽的系統(tǒng)進(jìn)化和分歧進(jìn)化時間進(jìn)行了研究; 海膽多糖可以通過免疫調(diào)節(jié)和抗氧化途徑,達(dá)到抗腫瘤作用[8]; 劉純慧等[9]在光棘球海膽中成功分離出幾種多糖純品,并做了抗腫瘤和免疫活性的研究,對馬糞海膽生殖腺多糖的制備未見報道。

傳統(tǒng)多糖提取方式一般為高溫水提,作者以馬糞海膽生殖腺粗多糖得率為指標(biāo),研究提取溫度、提取時間、料水比、提取次數(shù) 4個因素對馬糞海膽生殖腺粗多糖提取的影響,采用 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法研究馬糞海膽生殖腺粗多糖提取工藝,為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

多元線性回歸 (Multiple linear regression)方法是實(shí)驗(yàn)中一個常用的方法,回歸方程如下所示：

在方程中Y是性質(zhì),也就是因變量,X1到Xn代表不同的描述符,b1到bn代表這些描述符的系數(shù),b0是方程的截矩。本方法是在SPSS軟件中運(yùn)行。

多元線性逐步回歸分析的優(yōu)點(diǎn),在于能在為數(shù)眾多的變量中,經(jīng)過篩選找出較為重要的因子,以建立對觀測數(shù)據(jù)最優(yōu)化的回歸方程。所謂最優(yōu)化的方程具有以下兩方面的意義: 一方面,為了預(yù)報精確,希望在最終的回歸方程中包含了盡可能多的因素,特別是那些對Y有顯著作用的因素不能遺漏; 另一方面,為了使用方便,又希望預(yù)報方程中包含盡量少的變量,況且若方程中包含對因變量根本不起作用或作用很小的量,那么剩余平方和不僅不會由于這些變量而減少多少,相反由于(剩余) 自由度的減少,剩余方差反而有可能增大。同時,這些對因變量影響不顯著的變量,也會影響回歸方程的穩(wěn)定性,使回歸方程的效果降低[10]。

1 材料、儀器與試劑

馬糞海膽為市售,2009年4月購于煙臺紅利海鮮市場。主要儀器：20PR-520型冰凍離心機(jī)(日本Hitachi Koki有限公司); R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司); DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司); T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司); 所有試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正交實(shí)驗(yàn)方案

影響多粗糖提取的主要因素為提取溫度、提取時間、料水比、提取次數(shù),故選用這 4項(xiàng)為考察因素,每個因素擬定 3個水平。選用 L9(34)正交表(表1),共做9組實(shí)驗(yàn)。

表1 4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)表Tab.1 The orthogonal experimental design chart with four variables and three levels

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

取新鮮馬糞海膽生殖腺,粉碎,使用等量丙酮浸泡,8 h后,倒出上層丙酮,反復(fù)4次,收集殘渣減壓濃縮,真空干燥至恒重,經(jīng)上述步驟除去脂類等雜質(zhì)[11]。取干燥至恒重的殘渣9份,每份1g,放入100 mL提取瓶中,按正交方案提取。正交實(shí)驗(yàn)中每次倒出的提取液經(jīng)7 000 r/min離心10 min,收集上清液,沉淀轉(zhuǎn)回提取瓶中繼續(xù)提取。最后將水提多糖溶液濃縮定容在50 mL容量瓶中。

2.3 苯酚-硫酸法測定總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[12],精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.171 1g,定容至100 mL容量瓶中,蒸餾水溶解并稀釋至刻度。得到1.711 g/L葡萄糖溶液。精密吸取1.711 g/L葡萄糖溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3 mL,分別置于50 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容至刻度,即得系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL,置于10 mL比色管中,以1 mL蒸餾水為空白,每管加經(jīng)重蒸的5%的苯酚1mL,加蓋并混勻。再分別加入5mL濃硫酸,加蓋,于漩渦振蕩器上徹底混勻1min,室溫靜置5min,沸水浴加熱 10 min,取出后冷水浴冷卻至室溫,于490 nm波長處測定吸光度,以吸光度A對應(yīng)濃度C回歸。

2.4 樣品多糖含量的測定

分別精密吸取 0.25 mL正交實(shí)驗(yàn)樣品,蒸餾水補(bǔ)齊1 mL,按“硫酸苯酚法測定總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”方法測定A值,并帶入回歸方程計算多糖濃度。則馬糞海膽生殖腺粗多糖得率計算公式為：

式中：T為馬糞海膽生殖腺粗多糖得率,m為樣品檢測時稀釋倍數(shù),本實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)為4,D為待測多糖樣品溶液體積,本實(shí)驗(yàn)體積為50 mL,c為多糖濃度,M為馬糞海膽生殖腺質(zhì)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 正交實(shí)驗(yàn)樣品多糖含量測定

(1)苯酚-硫酸法多糖回歸方程A=8.1723C-0.0567(R2=0.999 2),其中,A為吸光度,C為糖濃度。(2)線性范圍0.017 11～0.102 66 g/L。硫酸苯酚法測定總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 硫酸苯酚法測定總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve for glucose determination by the phenol sulfuric acid method

用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定正交實(shí)驗(yàn)所得樣品的多糖含量,結(jié)果見表2。根據(jù)表2的極差分析,可知,D因素(提取次數(shù))的極差最大,C因素(料水比)次之,A因素(提取溫度)最小。所以影響馬糞海膽生殖腺粗多糖提取工藝的因素大小為：提取次數(shù)>料水比>提取時間>提取溫度,見圖2。

3.2 馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取的最佳工藝

根據(jù)極差分析,得到馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取的最佳工藝—A1B1C3D3,即 70℃水浴 1 h,料水比為1:20,共3次。按上述9組同樣操作,驗(yàn)證最佳條件,共平行3組。得率平均值為1.66%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal experiments

圖2 極差分析Fig.2 The analysis of the range

3.3 多元線性回歸模型(MLR)的建立

對正交實(shí)驗(yàn)所取的 4 個自變量(Xi) 和確定的應(yīng)變量(Y),采用 SPSS 統(tǒng)計軟件對上述相關(guān)參數(shù)進(jìn)行逐步回歸,建立海膽多糖得率和提取參數(shù)之間的線性模型：

式中：T為提取溫度,t為提取時間,r為料水比,n為提取次數(shù)。所得到的模型的R=0.922,F=2.854,說明多糖得率和提取工藝有顯著的相關(guān)關(guān)系。

3.4 MLR模型的預(yù)測

為了檢驗(yàn)建立的回歸模型的合理性,用正交試驗(yàn)中的3號和8號進(jìn)行預(yù)測,預(yù)測值及實(shí)驗(yàn)值見表3。

表3 MLR模型的預(yù)測結(jié)果Tab.3 The predicted results of the MLR model

從表中可以看出MLR模型對于3號和8號實(shí)驗(yàn)的預(yù)測結(jié)果較滿意,說明此模型具有很好的預(yù)測能力,可以應(yīng)用于多糖得率的預(yù)測,為實(shí)驗(yàn)提供了很好的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

筆者認(rèn)為,針對海洋生物多糖的提取類實(shí)驗(yàn),在一定范圍內(nèi),料水比、提取次數(shù)、提取時間與得率一般均正相關(guān),所以采用正交實(shí)驗(yàn),用極差分析得到的最佳條件不一定是最大值,實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這個結(jié)論。但是通過正交實(shí)驗(yàn)找到影響提取得率的因素的大小還是非常有必要的,它可以在指導(dǎo)生產(chǎn)的過程中降低成本。同時,采用正交實(shí)驗(yàn)可以通過具有代表性的實(shí)驗(yàn)建立線性模型,使得到的線性方程具有更廣泛的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)研究馬糞海膽多糖的提取工藝,并首次用正交實(shí)驗(yàn)多得到的結(jié)果建立了海膽多糖得率和提取參數(shù)之間的多元線性回歸模型,將所得到的模型用于海膽多糖得率的預(yù)測,結(jié)果令人滿意,說明此模型可以用于多糖得率的預(yù)測,所以該模型可以應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

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