鄧守恒 楊敬寧 曹鳳軍 蔡曉軍 鄧守平 陳萍

殼聚糖 [β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是一種來(lái)源于海洋生物的堿性生物多糖,具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性,且生物相容性良好,幾乎無(wú)毒性及其他不良反應(yīng),在現(xiàn)代藥物制備中經(jīng)常作為良好的藥物材料進(jìn)行開(kāi)發(fā)[1]。硒是人和動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素之一,亦具有廣泛的抗氧化,抗腫瘤,抗炎等活性,硒化殼聚糖[2]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下,以混合金屬離子為催化劑,通過(guò)拼合原理制備的有機(jī)硒,具有硒和多糖的雙重功效。本實(shí)驗(yàn)觀察了硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響,并分析了可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 硒化殼聚糖由福建醫(yī)科大學(xué)藥化系合成,含硒量為 0.4%;DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)及小牛、胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、四甲偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自 Sigma公司;3H-脫氧胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)購(gòu)自北京中國(guó)原子能研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 多孔細(xì)胞樣品收集器(上海分析儀器總廠);倒置顯微鏡(日本 Olympus公司);BeckmanLX20全自動(dòng)生化測(cè)定儀(美國(guó) Beckman Coulter公司);Medal680酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司);LS3801型液閃計(jì)數(shù)儀(美國(guó) Beckman Coulter公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將術(shù)中取下的包皮在無(wú)菌條件下漂洗,剪成1mm×1mm×1mm組織塊,培養(yǎng)于含 15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 3天換 1次液,待長(zhǎng)成致密單層后,用濃度為 2.5 g/L的胰酶消化,按體積比為 6傳代,第 6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[3],用細(xì)胞培養(yǎng)液配制硒化殼聚糖,根據(jù)硒化殼聚糖濃度不同分為空白對(duì)照組、25、50、100、200、400mg/L共 6組。

1.3.2 倒置顯微鏡觀察：取第 6代細(xì)胞,5×108個(gè)/L接種于24孔板,每孔接種 0.5ml,CO2箱培養(yǎng) 24 h后分為試驗(yàn)組和對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng) 48h,于倒置顯微鏡下觀察,照相。

1.3.3 MTT法檢測(cè)硒化殼聚糖對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 取第6代細(xì)胞,5×103個(gè)/ml接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng) 48 h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換培養(yǎng)液為 DMEM(100μl/孔),加入濃度為 5 g/L的MTT(25μl/孔)繼續(xù)培養(yǎng) 4h后加入二甲基亞砜(100μl/孔),于波長(zhǎng) 540 nm處測(cè)各光密度值。

1.3.4 硒化殼聚糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響：取第 6代細(xì)胞,5×103個(gè)/m l接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng)24 h貼壁后按分組加入不同濃度硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng),每天消化加藥孔和對(duì)照孔各 3孔細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算均值,隔天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液并加藥,以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線,倍增時(shí)間的計(jì)算公式[4]：細(xì)胞倍增時(shí)間 =培養(yǎng)時(shí)間(d)×log2/(log起始細(xì)胞數(shù) -log培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù))。

1.3.5 3H-TdR摻入法測(cè)定 DNA合成[5]：取第 6代細(xì)胞,5×103個(gè)/m l接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng)48h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后加入3H-TdR 37MBq/L,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后用 0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移至玻璃纖維濾紙上,依次用 0.9%氯化鈉溶液、10%三氯醋酸、無(wú)水乙醇沖洗固定干燥后加閃爍液,液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘閃爍次數(shù)值(counts perminute,cpm)。

1.3.6 LDH漏出率的測(cè)定[6]：取第 6代細(xì)胞,5×103個(gè)/ml接種于 96孔板,每孔接種 100μl,CO2箱培養(yǎng) 48 h,按分組加入不同濃度的硒化殼聚糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上清液中 LDH的含量,將培養(yǎng)板中的細(xì)胞用 0.25%胰酶消化,收集細(xì)胞,超聲波粉碎后加入 PBS液,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè) LDH的含量,LDH漏出率的計(jì)算公式：漏出率 =(LDH上清液-LDH胞內(nèi))/LDH胞內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 6組細(xì)胞均呈放射狀排列,排列規(guī)則整齊,胞體較大,生長(zhǎng)良好,各藥物濃度組與空白對(duì)照組相比,外觀形態(tài)未發(fā)生明顯改變。見(jiàn)圖 1。

2.2 MTT法及3H-TdR摻入法檢測(cè)硒化殼聚糖對(duì)成纖維細(xì)胞增殖影響 硒化殼聚糖能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,25mg/L及以上濃度硒化殼聚糖即可使成纖維細(xì)胞數(shù)量增加,對(duì) 540 nm波長(zhǎng)光線吸收增多,促進(jìn)成纖維細(xì)胞對(duì) 3H-TdR的摻入。50mg/L硒化殼聚糖組吸光度值大于空白對(duì)照組(P＜0.05)。400mg/L硒化殼聚糖組 cpm值大于空白對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)表 1、圖 1。

表1 硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響±s

表1 硒化殼聚糖對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響±s

注： 與空白對(duì)照組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 吸光度值(A) cpm值空白對(duì)照組 0.481±0.02 1 0564±356 25 mg/L硒化殼聚糖組 0.513±0.02 1 4872±390＊50 mg/L硒化殼聚糖組 0.558±0.01＊ 1 5281±365＊100mg/L硒化殼聚糖組 0.602±0.01＊ 1 5821±487＊200mg/L硒化殼聚糖組 0.627±0.01＊ 1 6734±397＊400mg/L硒化殼聚糖組 0.633±0.02＊ 1 8658±356#

2.3 硒化殼聚糖對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及 LDH漏出率影響 從生長(zhǎng)曲線來(lái)看各濃度硒化殼聚糖組成纖維細(xì)胞增殖均比空白對(duì)照組明顯增快,先于空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽合密度而進(jìn)入停滯期,隨后細(xì)胞出現(xiàn)退化死亡。根據(jù)公式計(jì)算可知,400mg/L硒化殼聚糖組的群體倍增時(shí)間與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),其他各濃度組細(xì)胞群體倍增時(shí)間均比空白對(duì)照組有所縮短。硒化殼聚糖可降低皮膚成纖維細(xì)胞 LDH漏出率,隨著藥物劑量的加大漏出率降低越來(lái)越明顯,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,當(dāng)劑量 ＞100mg/L時(shí),對(duì) LDH漏出率的影響與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 2、圖 1。

圖 1 硒化殼聚糖對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

表 2 硒化殼聚糖對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間和 LDH漏出率的影響±s

表 2 硒化殼聚糖對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間和 LDH漏出率的影響±s

注：與空白對(duì)照組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 倍增時(shí)間(d) LDH漏出率(U/ml)空白對(duì)照組 3.54±0.01 25.11±1.26 25 mg/L硒化殼聚糖組 3.19±0.01 23.76±1.14 50 mg/L硒化殼聚糖組 3.05±0.01＊ 23.21±1.76 100mg/L硒化殼聚糖組 2.84±0.01＊ 17.61±1.29＊200mg/L硒化殼聚糖組 2.80±0.01# 16.23±1.17#400mg/L硒化殼聚糖組 2.74±0.01# 15.98±0.89#

3 討論

MTT是一種黃色的水溶性染料,活細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上具有有活性的琥珀酸脫氫酶,該酶可使黃色的 MTT還原為藍(lán)紫色的甲臢顆粒,活細(xì)胞數(shù)量越多,細(xì)胞內(nèi)甲臢顆粒越多,其對(duì)540nm波長(zhǎng)光線吸收也越多,我們可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞在540 nm波長(zhǎng)處吸光度值來(lái)了解活細(xì)胞數(shù)量多少,吸光度值越大,活細(xì)胞數(shù)目就越多,細(xì)胞增殖也就越旺盛。本實(shí)驗(yàn)中,筆者采用 MTT法檢測(cè)了硒化殼聚糖對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的作用并研究了其對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響,結(jié)果顯示硒化殼聚糖能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,25mg/L硒化殼聚糖作用成纖維細(xì)胞 24 h,即可使細(xì)胞增殖加快,數(shù)量增加,濃度越高,效果越明顯。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖也顯示,各濃度硒化殼聚糖均可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,比空白對(duì)照組先進(jìn)入平臺(tái)期,成纖維細(xì)胞經(jīng)各濃度硒化殼聚糖處理后,細(xì)胞群體倍增時(shí)間均比空白對(duì)照組有所縮短。

脫氧胸腺嘧啶核苷酸是合成DNA的原料之一,細(xì)胞分裂增殖旺盛則 DNA合成加快,細(xì)胞對(duì)脫氧胸腺嘧啶核苷酸的需求量增加。本研究采用 3H-TdR摻入量測(cè)定發(fā)現(xiàn)硒化殼聚糖可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞對(duì) 3H-TdR摻入量,促進(jìn)成纖維細(xì)胞DNA復(fù)制合成,與MTT檢測(cè)結(jié)果一致。LDH是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解反應(yīng)的酶,進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),如果培養(yǎng)的細(xì)胞受損,LDH會(huì)由細(xì)胞漏出至培養(yǎng)液中,通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中 LDH可衡量細(xì)胞受損的程度,如果加入藥物干預(yù),可用于藥物安全性的考察[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和細(xì)胞內(nèi)LDH相對(duì)量來(lái)評(píng)價(jià)硒化殼聚糖對(duì)成纖維細(xì)胞損害情況,結(jié)果顯示硒化殼聚糖并沒(méi)有增加LDH的漏出率,反而能降低 LDH漏出率,對(duì)細(xì)胞起一定的保護(hù)作用,同時(shí)光鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)上未出現(xiàn)明顯受損改變,顯示其不良反應(yīng)較小,其藥用價(jià)值值得進(jìn)一步研究。

1 Zarzycki R,Modrzjewska Z.Use of chitosan in medicine and biomedical engineering.Polim Med,2003,33：47-58.

2 孫蘭萍,張勝義,許暉.硒化殼聚糖的制備及理化性質(zhì)的研究.食品工業(yè)科技,2006,27：145-151.

3 黎鰲,楊宗誠(chéng)主編.實(shí)驗(yàn)燒傷外科學(xué).第 1版.重慶：重慶大學(xué)出版社,1997.268-269.

4 Tomas P.Vickery Trinkaus-Randall.Regulation ofbasic fibroblastgrowth factor binding and activity by cell density and heparan sulfate.The Journal of Biological Chemistry,1999,274：534-540.

5 Shin VY,Liu ES,Koo MW,et al.Cigarette smoke extracts delay wound healing in thestomach：involvementofpolyam ine synthesis.Exp Biol Med(Maywood),2002,227：114-124.

6 洪慶濤,宋岳濤.細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶漏出率的比色測(cè)定及其應(yīng)用.細(xì)胞生物學(xué)雜志,2004,226：74-79.

7 Lobner D.Comparison of the LDH and MTT assays for quantifying cell death：validity for neuronal apoptosis.Journal of Neuroscience Methods,2000,96：147-152.