張魯冀，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150030）

酸菜是一種中國(guó)北方傳統(tǒng)的腌漬蔬菜制品，酸菜汁中富含豐富的乳酸菌[1-2]，是巨大的乳酸菌資源庫(kù)。目前人們從酸菜中分離出的乳桿菌主要有植物乳桿菌，短乳桿菌[3-5]，而分離得到的菌株主要集中在優(yōu)勢(shì)菌群范圍內(nèi)。除了這些優(yōu)勢(shì)菌群外，酸菜中還包含許多其他菌群，因此酸菜成為分離乳酸菌，尤其是乳桿菌的良好材料。本試驗(yàn)是從酸菜中分離乳桿菌，并采用傳統(tǒng)生理生化方法與分子生物學(xué)方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，為多角度開發(fā)利用東北酸菜中的微生物資源，發(fā)展相應(yīng)微生態(tài)制劑及深入研究其開發(fā)利用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及來(lái)源

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC 4356，購(gòu)自中科院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 自然發(fā)酵東北酸菜

15個(gè)自然發(fā)酵東北酸菜樣品采集自中國(guó)哈爾濱地區(qū)，樣品風(fēng)味口感良好。

1.1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BCN-1360生物潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司）；光學(xué)顯微鏡（OLMPUS）；GL-2M離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所）；HIRAYAma HVE-50型高壓滅菌器（日本HIRAYAma公司）；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微量進(jìn)樣器（美國(guó)Eppendorf公司）；ABI 9700 PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.1.4 各種培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[6]的方法配制。磷酸鹽緩沖液、0.9%生理鹽水和革蘭氏染色液按照文獻(xiàn)[6-8]的方法配制。H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)以及各種碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)試劑為浙江省杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。1 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）、TE緩沖液、TAE緩沖液按照文獻(xiàn)[9]配制。基因組DNA提取試劑盒、marker購(gòu)自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 自然發(fā)酵酸菜樣品的采集及前處理

酸菜樣品采集后裝于無(wú)菌試管中，封好放入冰盒內(nèi)保持低溫，立刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.2.2 菌株的分離與純化

取酸菜汁以3%的接種量接入液體MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；然后將富集培養(yǎng)的菌液稀釋成10-1～10-77個(gè)梯度，分別涂布于含有0.75%CaCO3的MRS平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，在菌落數(shù)為30～300個(gè)之間的平板上挑選出周圍形成透明圈的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，凡革蘭氏陽(yáng)性菌落，繼續(xù)劃線于MRS平板，直至確定為純菌，純化后的菌株儲(chǔ)存在MRS斜面培養(yǎng)基中，放置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 分離菌株的生理生化試驗(yàn)

凡是革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的菌株初步確定為乳酸菌。在初步鑒定的基礎(chǔ)上，接著進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)[6,10-11]。

1.2.4 分離菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn)

種的鑒定主要依據(jù)分離菌株對(duì)碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果，即通過(guò)對(duì)單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來(lái)區(qū)分[6,10-11]。

1.2.5 分離菌株基因組DNA的提取

基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟參照說(shuō)明書。

1.2.6 PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列

PCR擴(kuò)增的引物[12]分別為:

PCR反應(yīng)體系[13-15]:10×PCR Buffer（Mg2+Plus），5μL；dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1each），4μL；引物 P1，1μL；引物 P2，1μL；模板，2μL；Ta-KaRa Taq 酶（5 U·μL-1），0.5μL；ddH2O，36.5μL。

PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃、5 min，變性94℃、1 min，退火58℃、1 min，延伸72℃、2 min，末端延伸72℃、10 min。循環(huán)數(shù)為30個(gè)。

1.2.7 16S rDNA基因測(cè)序與同源性分析

目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST軟件，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表基因序列進(jìn)行序列比對(duì)[16]，從而最終確定目的基因的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

本試驗(yàn)從15份自然發(fā)酵東北酸菜樣品中共分離得到革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的桿菌21株。分離菌株的菌體細(xì)胞形態(tài)為短桿或短粗桿狀，多數(shù)單獨(dú)，或成對(duì)存在。在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌落主要特征為表面光滑、邊緣整齊、中間突起或扁平的白色菌落。在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，菌株的培養(yǎng)特性各不相同。有的上部液體澄清，底部菌體形成較厚的圓形沉淀；有的上部液體渾濁，底部菌體形成較薄的圓形沉淀；有的底部菌體有向上貼壁生長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.2 分離菌株的生理生化特征及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的生理生化特征及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表1。反應(yīng)結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）進(jìn)行比較[10]，得出酸菜汁中分離得到的21株菌株的H2O2酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)均為陰性，符合乳桿菌屬的特征，所以初步判定為乳桿菌屬。從糖發(fā)酵鑒定結(jié)果來(lái)看，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC4356與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的性質(zhì)完全相同；而L4、L14、L17、L21、L22、L33與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的性質(zhì)相近。L3、L5、L6、L12、L18、L19、L28、L30與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的性質(zhì)相近。L7、L9、L10、L27、L31、L32與羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的性質(zhì)相近。L20與米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）的性質(zhì)相近。

表中做標(biāo)記的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[17]中給出的標(biāo)準(zhǔn)菌株糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果有差別，可能是由于菌株自身的某種特性或在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生變異導(dǎo)致菌株的部分糖醇發(fā)酵結(jié)果發(fā)生改變，造成了單純利用生理生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行鑒定存在一定的困難。因此，為了對(duì)目的菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，采用16S rDNA序列同源性分析的方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

表1 菌株的生理生化特征及糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table1 Physiological-biochemical properties and sugar fermentation results of these strains

續(xù) 表

續(xù) 表

2.3 分離菌株基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分離菌株的基因組DNA電泳見圖1。結(jié)果表明，基因組DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，可用于16S rDNA序列的擴(kuò)增。

分離菌株基因組16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖2。菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，所得的擴(kuò)增片段大小在1500bp左右的特異性條帶，滿足測(cè)序要求。

圖1 基因組DNA電泳Fig.1 Gel electrophoresis of genomic DNA

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR-amplified fragments

2.4 測(cè)序結(jié)果及16S rDNA序列同源性分析

將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC4356及21株分離菌株的16S rDNA序列輸入到GenBank中，尋找與其同源性最高的菌種，結(jié)果見表2。

表2 分離菌株的16S rDNA序列同源性分析Table2 16S rDNA Homology Analysis

由表2可知，分離菌株的16S rDNA序列同GenBank中該屬內(nèi)菌株的16S rDNA已知序列做比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATCC4356與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）同源性最高；L4、L14、L17、L21、L22、L33與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高；L3、L5、L6、L12、L18、L19、L28、L30與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）同源性最高；L7、L9、L10、L27、L31、L32與羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）同源性最高；L20與米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）同源性最高；而且同源性均可達(dá)到99.4%以上。由此可以推斷，對(duì)于表形特征發(fā)生變化的細(xì)菌，在用傳統(tǒng)的生理生化方法不能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的情況下，可以通過(guò)16S rDNA序列同源性分析的方法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定[18-19]。16S rDNA序列同源性分析結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明:通過(guò)16S rDNA序列同源性分析的方法可以將試驗(yàn)菌株準(zhǔn)確鑒定到種的水平。因此可以采用生理生化方法與16S rDNA基因序列測(cè)定相結(jié)合的方法對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)分離得到6株植物乳桿菌，8株短乳桿菌，李文斌等的研究結(jié)果也表明:酸菜中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌為植物乳桿菌和短乳桿菌[20]。除此之外，本試驗(yàn)還分離出1株米酒乳桿菌，6株羅伊氏乳桿菌。本試驗(yàn)的下一步工作將對(duì)分離的菌株的特性進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

a.從15份自然腌漬的東北酸菜樣品中分離得到21株乳桿菌。

b.在傳統(tǒng)生理生化初步鑒定的基礎(chǔ)上，再利用16S rDNA序列同源性分析方法對(duì)21株乳桿菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn):6株為植物乳桿菌，8株為短乳桿菌，6株為羅伊氏乳桿菌，1株為米酒乳桿菌。16S rDNA序列同源性分析方法可以準(zhǔn)確地將未知細(xì)菌鑒定到種的水平。

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