盧 麗，李樹(shù)峰，佟慧麗，馮 霞，徐婷婷，嚴(yán)云勤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式，指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過(guò)程[1-2]。細(xì)胞凋亡研究一直以動(dòng)物細(xì)胞為模型，取得了很多成果。但由于動(dòng)物細(xì)胞代謝通路復(fù)雜且具有種屬和時(shí)空特異性，發(fā)展到一定階段給研究帶來(lái)了困難。

自1997年madeo等首次報(bào)導(dǎo)了酵母細(xì)胞的凋亡后，使人們認(rèn)識(shí)到，不僅多細(xì)胞真核生物可發(fā)生凋亡，單細(xì)胞真核生物也可發(fā)生凋亡，并且像酵母這樣的單細(xì)胞生命凋亡能很好地簡(jiǎn)化研究過(guò)程[3]。此后研究發(fā)現(xiàn)，多種外源因素均能導(dǎo)致酵母細(xì)胞凋亡，如H2O2、次氯酸、阿司匹林、乙酸、NaCl、葡萄糖等。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)酵母基因組編碼很多執(zhí)行細(xì)胞死亡基本分子機(jī)制的蛋白質(zhì)，如凋亡蛋白抑制因子IAP（Bir1）和與線粒體相關(guān)聯(lián)的caspases、Aif、HtrA2/Om（iNma111）等[4-5]，有的酵母凋亡中還涉及線粒體中的Fis1、Nuc1、Ndi1[6]，活性氧（ROS）在酵母凋亡中也起著重要作用。由不同因素引起的酵母凋亡，可能具有不同的分子機(jī)制。由于酵母與多細(xì)胞動(dòng)物凋亡的相似性，酵母作為一種簡(jiǎn)單的生物模型體系，可能有助于闡明和發(fā)現(xiàn)新的凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制。

乳酸是某些特殊酵母發(fā)酵的正常終產(chǎn)物，在釀造啤酒時(shí)，加入適量乳酸既能調(diào)整pH促進(jìn)糖化，有利于酵母發(fā)酵，提高啤酒質(zhì)量，又能增加啤酒風(fēng)味，延長(zhǎng)保質(zhì)期。在白酒、清酒和果酒中乳酸可用于調(diào)節(jié)pH，防止雜菌生長(zhǎng)，增強(qiáng)酸味和清爽口感。在某些方面，乳酸與酵母有著很大的關(guān)聯(lián)，所以，研究乳酸對(duì)酵母凋亡的影響及其相關(guān)基因的表達(dá)變化，可指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)乳酸的應(yīng)用，同時(shí)為其凋亡通路的深入研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株Y187由朱延明教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑

溶細(xì)胞（Lytiase酶）購(gòu)自Solarbio；Taq酶和其他PCR試劑（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司）；TUNEL試劑盒（購(gòu)自Promega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自康為生物有限公司）。其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

首先使用水利普查基層登記臺(tái)賬管理系統(tǒng)菜單中的“對(duì)象清查清查瀏覽”功能，點(diǎn)擊業(yè)務(wù)分類(lèi)的每一項(xiàng)，通過(guò)“導(dǎo)出EXCEL”功能，分別形成與Q201～Q803內(nèi)容對(duì)應(yīng)的24張瀏覽表，如表Q201（水庫(kù)工程）導(dǎo)出名為“VIEW_Q201_0.XLS”。為了避免數(shù)據(jù)的無(wú)序性和方便后面的操作，應(yīng)在軟件中先按水利普查自動(dòng)生成的編碼排序后再導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.1.3 引物

所有引物均用primer5.0軟件設(shè)計(jì)，上海生工公司合成，所設(shè)計(jì)引物序列、退火溫度和擴(kuò)增片段大小如下:

1.2 方法

1.2.1 酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 乳酸處理酵母

當(dāng)YPD液體培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)前期（OD=0.6～0.9）時(shí)，調(diào)pH 3.0后，分別加入0、200、250、300 mmol·L-1的終濃度乳酸培養(yǎng) 200 min，而250 mmol·L-1終濃度的乳酸分別培養(yǎng)120、200、260 min。

1.2.3 酵母細(xì)胞死亡與凋亡的檢測(cè)

酵母細(xì)胞死亡檢測(cè)采用美蘭染色法[7]。酵母細(xì)胞的檢測(cè)采用DAPI染色法、PI染色法、TUNEL染色法[8-10]。RT-PCR法檢測(cè)一些凋亡相關(guān)的基因表達(dá)按試劑盒指南操作。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

RT-PCR結(jié)果經(jīng)Glyko BandScan4.3進(jìn)行OD值掃描后，數(shù)據(jù)采用DPS7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和死亡率檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

采用分光光度計(jì)法測(cè)量酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，培養(yǎng)8 h左右，酵母生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)期，隨后培養(yǎng)到約18 h這個(gè)區(qū)間，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，基本呈幾何級(jí)數(shù)生長(zhǎng)。培養(yǎng)20 h后，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)極其緩慢，基本處于停滯狀態(tài)，此時(shí)，酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，如圖1所示。

2.1.2 酵母細(xì)胞的死亡情況

根據(jù)前人試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)酵母細(xì)胞被外源刺激3 h后死亡率達(dá)到80%～90%時(shí)，凋亡的程度最大。所以本試驗(yàn)通過(guò)一系列的試驗(yàn)選擇200、250、300 mmol·L-1三個(gè)乳酸終濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

用美蘭溶液對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行染色，普通光鏡下觀察到死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞沒(méi)有被染上色。在本試驗(yàn)中乳酸的三個(gè)濃度處理的酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)被完全抑制，隨著乳酸濃度的增加，死亡比率逐漸增加，200 mmol·L-1終濃度的乳酸處理酵母細(xì)胞200 min，約有30%左右的細(xì)胞發(fā)生死亡；250 mmol·L-1終濃度的乳酸處理120、200和260 min時(shí)，酵母的死亡率在55%～62%之間；當(dāng)乳酸終濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，處理120 min后，死亡率基本達(dá)到90%，該濃度處理的前120 min內(nèi)，酵母的死亡比率增長(zhǎng)很快（見(jiàn)圖2）。

圖1 酵母細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of yeast cell in YPD culture medium

圖2 乳酸處理酵母細(xì)胞的死亡率曲線Fig.2 Mortality rate curve of lactic acid treatment yeast cells

2.2 凋亡情況檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 DAPI染色情況

DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，正常的細(xì)胞核核形完整，染色質(zhì)均勻，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，向外周聚集，形成周邊化，緊接著染色質(zhì)進(jìn)一步固縮，形成很多顆粒物，最后細(xì)胞核破裂形成碎片，核解體。因本試驗(yàn)中300 mmol·L-1的終濃度乳酸處理200 min可引起90%左右的酵母細(xì)胞死亡，如果引起的死亡是以凋亡的形式進(jìn)行，那么這個(gè)條件的死亡率應(yīng)該凋亡程度最大。所以對(duì)可能引起最大凋亡程度的300 mmol·L-1乳酸終濃度處理的酵母進(jìn)行凋亡檢測(cè)。DAPI染色后，在熒光共聚焦顯微鏡下可觀察到酵母細(xì)胞發(fā)生核斷裂和核降解的凋亡表型（見(jiàn)彩版Ⅰ），核斷裂而產(chǎn)生核擴(kuò)散的狀態(tài)，圖中染色的范圍比對(duì)照組的細(xì)胞大一些，可以初步確定乳酸能夠引起酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡，但還需做進(jìn)一步的凋亡驗(yàn)證。

2.2.2 PI染色情況

酵母細(xì)胞進(jìn)行PI染色后，在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)如圖3所示，對(duì)照組的細(xì)胞，PI透膜率基本為零，即基本沒(méi)有細(xì)胞被染色；200 mmol·L-1乳酸處理200 min后PI透膜被染成紅色的細(xì)胞僅約2%～4%；引起90%左右死亡率的300 mmol·L-1乳酸處理200 min后的檢測(cè)結(jié)果僅有少于10%的細(xì)胞被染色。可見(jiàn)，本試驗(yàn)設(shè)置的三種乳酸濃度的PI透膜率相比于細(xì)胞的死亡率是非常小的一部分，基本可以忽略。由于PI僅能透過(guò)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而對(duì)核染色，但細(xì)胞發(fā)生死亡而沒(méi)有被PI染色，說(shuō)明大部分死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜并沒(méi)有遭到破壞，這符合凋亡發(fā)生的情況，所以進(jìn)一步確定是凋亡作用的結(jié)果。

圖3 不同終濃度乳酸處理酵母細(xì)胞200 min的透膜率Fig.3 Through membrane rate of different densities of final lactic acid treatment yeast cells in 200 min

2.2.3 TUNEL染色情況

TUNEL是一種用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的分析方法，細(xì)胞凋亡時(shí)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，TUNEL可以有效的去探測(cè)DNA片段的產(chǎn)生。酵母細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組的酵母細(xì)胞沒(méi)有顯示TUNEL陽(yáng)性。200 mmol·L-1終濃度乳酸處理酵母細(xì)胞200 min，TUNEL陽(yáng)性率不到30%，當(dāng)終濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，TUNEL陽(yáng)性率可達(dá)到80%以上，可見(jiàn)隨著乳酸濃度的增加TUNEL的陽(yáng)性率逐漸增加（見(jiàn)彩版Ⅱ）。由250 mmol·L-1的終濃度乳酸處理培養(yǎng)酵母細(xì)胞不同時(shí)間，不同培養(yǎng)時(shí)間在本試驗(yàn)設(shè)置的這3個(gè)時(shí)間梯度中內(nèi)TUNEL陽(yáng)性率基本都在60%作用左右，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，TUNEL的陽(yáng)性率并沒(méi)有顯著變化。TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明通過(guò)以上的凋亡檢測(cè)基本可以斷定，乳酸引起的酵母細(xì)胞死亡是以凋亡的形式進(jìn)行，其凋亡程度隨乳酸處理濃度的增加而增加，但與乳酸處理時(shí)間無(wú)明顯改變。

2.3 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

圖4 不同濃度乳酸對(duì)酵母細(xì)胞基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of different densities of lactic acid on gene expression of yeast cells

本試驗(yàn)選擇了線粒體中與凋亡相關(guān)的幾個(gè)蛋白基因（Yca1、Aif1、Nma111、Nuc1、Ndi1、Fis1、SOD1、SOD2）和酵母中唯一的凋亡蛋白抑制因子Bir1。通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)這幾個(gè)基因的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，隨著乳酸終濃度的增加及凋亡程度的增加，得到Fis1、Bir1、SOD1、SOD2四種基因的表達(dá)量隨之降低且差異顯著（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。圖中第1泳道的對(duì)照組中，四種基因均有表達(dá)，隨著乳酸處理濃度（即凋亡程度）的增加，這四種基因的表達(dá)都呈遞減趨勢(shì)，而且1與2，2與3，3與4間的差異均顯著（P＜0.05）；當(dāng)乳酸終濃度達(dá)到300 mmol·L-1引起約80%以上的凋亡時(shí)，這四種基因的表達(dá)量最低。但處理時(shí)間的增加對(duì)這四種基因表達(dá)并沒(méi)有顯著改變（P＞0.05）。Yca1、Aif1、Nma111、Nuc1、Ndi1基因的表達(dá)隨著處理濃度和時(shí)間的增加都沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。

3 討論

醋酸、酒精等多種外源刺激可引起酵母凋亡，顯現(xiàn)與動(dòng)物相似的凋亡表型，乳酸作為酵母發(fā)酵的產(chǎn)物之一和工業(yè)添加劑影響酵母的作用價(jià)值，但其對(duì)酵母凋亡的影響還未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)的研究表明，在酵母的凋亡過(guò)程中線粒體、Yca1和ROS具有中心作用[12]，凋亡蛋白抑制因子Bir1具有重要調(diào)控作用，所以在乳酸引起的酵母凋亡中，檢測(cè)線粒體中的相關(guān)基因、ROS相關(guān)基因和Bir1基因表達(dá)變化，對(duì)細(xì)胞凋亡理論研究及指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐有一定的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

在本試驗(yàn)條件下，200 mmol·L-1的乳酸已經(jīng)完全抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)并使細(xì)胞死亡，隨著處理濃度的增加，酵母細(xì)胞的死亡率隨之增加。DAPI染色可知，乳酸引起酵母細(xì)胞核斷裂和核降解，這是凋亡細(xì)胞的特征；能夠區(qū)分壞死和凋亡的PI染色表明，幾乎所有死亡的酵母細(xì)胞膜并沒(méi)有破壞，乳酸引起的酵母細(xì)胞死亡屬于細(xì)胞凋亡；TUNEL染色進(jìn)一步證明，乳酸引起的酵母細(xì)胞死亡是以凋亡的形式進(jìn)行，而且，隨著乳酸處理濃度的增加，酵母的凋亡程度也隨之增加。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母細(xì)胞的死亡率和凋亡率都無(wú)顯著變化，這種無(wú)時(shí)間依賴(lài)性的原因可能是乳酸對(duì)酵母的損傷在處理的2 h內(nèi)乳酸的毒性已經(jīng)發(fā)揮作用，2 h后并沒(méi)有進(jìn)一步的損傷積累。

采用RT-PCR方法分析線粒體中的一些基因和酵母中唯一的凋亡蛋白抑制因子Bir1的基因表達(dá)變化，結(jié)果表明，隨著凋亡程度的增加Fis1、Bir1、SOD1、SOD2四個(gè)基因的表達(dá)量隨之降低。Fis1p在線粒體斷裂中起作用，也顯示抑制凋亡的功能，如Fis1酵母突變株經(jīng)H2O2處理后凋亡程度增加[6]。Fannjiang等研究表明，酵母Fis1p的抗凋亡功能能被Bcl-2或bcl-xl功能性替換，暗示Fis1p以類(lèi)Bcl-2方式作用[13]。而本試驗(yàn)中Fis1基因表達(dá)的降低，可能是其在凋亡的過(guò)程中起著一個(gè)類(lèi)Bcl-2的作用，具體作用機(jī)制有待深入研究。Bir1p是酵母中凋亡蛋白抑制因子IAP家族的唯一成員，抑制下游的caspase，Bir1p顯示抗凋亡功能，酵母細(xì)胞缺少Bir1p顯示典型的凋亡特征及ROS的產(chǎn)生[4]。本試驗(yàn)中Bir1基因表達(dá)的下降可能調(diào)節(jié)加強(qiáng)了Yca1p的激活從而促使凋亡發(fā)生；Yca1基因的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，它對(duì)凋亡的作用還有待于深入檢測(cè)其蛋白活力變化。對(duì)線粒體中的Aif1（凋亡誘導(dǎo)因子）、Nma111（細(xì)胞凋亡核介導(dǎo)因子Htra2/Omi類(lèi)蛋白）、Nuc1（核酸內(nèi)切酶）、Ndi1（人類(lèi)細(xì)胞AMID的酵母同源物）的檢測(cè)并沒(méi)有得到顯著的變化，為進(jìn)一步闡明這些蛋白在乳酸誘導(dǎo)凋亡中的作用，還需進(jìn)一步檢測(cè)其蛋白活力，或采用構(gòu)建突變株的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

本試驗(yàn)中在乳酸處理培養(yǎng)120～260 min酵母凋亡的黃金時(shí)間內(nèi)，隨著凋亡程度的增加，SOD1（細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶）、SOD2（線粒體超氧化物歧化酶）基因的表達(dá)隨之降低。Fabrizio等研究在酵母中任意過(guò)表達(dá)SOD1或SOD2可增加其壽命，酵母的長(zhǎng)期生存需要這二者[14]，但乳酸處理使酵母凋亡，壽命縮短，可能因此使SOD1和SOD2的表達(dá)降低。本試驗(yàn)所檢測(cè)的各基因在酵母凋亡過(guò)程中的相互關(guān)聯(lián)及其作用機(jī)制尚需深入研究。

4 結(jié)論

a.乳酸引起的酵母細(xì)胞死亡具有劑量依賴(lài)性，無(wú)時(shí)間依賴(lài)性。

b.經(jīng)DAPI、PI、TUNEL染色證明，乳酸引起的酵母細(xì)胞死亡是以凋亡的形式進(jìn)行。

c.RT-PCR檢測(cè)表明，與凋亡相關(guān)的Fis1、Bir1、SOD1、SOD2基因的表達(dá)量隨著凋亡程度的增加而降低。

[1]范京惠,左玉柱,李一經(jīng).細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(6):804-807.

[2]劉翔,楊明瑜,曹燦,等.熱激誘導(dǎo)番茄果實(shí)細(xì)胞色素C的釋放[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(1):23-27.

[3]madeo F,Frohlich E,Frohlich K U.A yeast mutant showing diagnostic markers of early and late apoptosis[J].J Cell Biol,1997,139:729-734.

[4]Walter D,Wissing S,madeo F,et al.The inhibitor-of-apoptosis protein Bir1p protects against apoptosis in S.cerevisiae and is a substrate for the yeast homologue of Omi/HtrA2[J].J Cell Sci,2006,119:1843-1851.

[5]Wissing S,Ludovico P,Herker E,et al.An AIF orthologue regulates apoptosis in yeast[J].J Cell Biol,2004,166:969-974.

[6]Eisenberg T,Buttner S,Kroemer G,et al.The mitochondrial pathway in yeast apoptosis[J].Apoptosis,2007(12):1011-1023.

[7]白毓謙.微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]濟(jì)南:山東大學(xué)出版社,1987.

[8]周峻崗.釀酒酵母高爾基體搪基化及生物學(xué)功能的研究[D].遂寧:山東大學(xué),2007.

[9]Kitagaki H,Araki Y,Funato K,et al.Ethanol-induced death in yeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway[J].FEBS Letters,2007,581:2935-2942.

[10]Ludovico P,Sousa M J,Silva M T,et al.Saccharomyces cerevisiae commits to a programmed cell death process in response to acetic acid[J].Microbiology,2001,147:2409-2415.

[11]Aguila E M D,Dutra M B,Silava J T,et al.Comparing protocols for preparation of DNA-free total yeast RNA suitable for RT-PCR[J].BMC Molecular Biology,2005,6:9.

[12]mazzoni C,Falcone C.Caspase-dependent apoptosis in yeast[J].Biochimica et Biophysica Acta,2008,1783:1320-1327.

[13]Fannjiang Y,Cheng W C,Lee S J,et al.Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast[J].Genes Dev,2004,18:2785-2797.

[14]Fabrizio P,Pletcher S D,Minois N,et al.Chronological agingindependent replicative lifee span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae[J].FEBS Lett,2004,557:136-142.