耿印印，王旭梅,*，王紅旗，佟秀春

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京 100875）

鎘是一種比較稀有的金屬，它極易蓄積在土壤中。在目前的重金屬污染中，鎘污染很突出，是面積最廣、危害最大的重金屬元素之一。有資料顯示，我國受鎘污染的耕地面積約1.33萬hm2。鎘對作物和蔬菜會產(chǎn)生毒害作用，并最終在植物可食部分積累而污染農(nóng)產(chǎn)品，而且可通過食物鏈進(jìn)入人體。當(dāng)其超過一定限量時，會對生態(tài)環(huán)境和人體造成危害。

目前，現(xiàn)有的鎘污染土壤修復(fù)方法普遍存在著二次污染、成本高、修復(fù)效果不理想等問題。而生物修復(fù)技術(shù)是最近30年來全球極力研究開發(fā)的一種綠色、經(jīng)濟(jì)的環(huán)境修復(fù)方法，其在治理土壤污染方面的作用越來越受到廣泛的關(guān)注。主要包括兩大類:植物修復(fù)技術(shù)和微生物修復(fù)技術(shù)。

鎘污染土壤的微生物修復(fù)是利用微生物的生物活性對重金屬的親合吸附或轉(zhuǎn)化為低毒產(chǎn)物，從而降低重金屬的污染程度。在長期受某種重金屬污染的土壤中，生存著很大數(shù)量的、能適應(yīng)重金屬污染環(huán)境并能氧化或還原重金屬的微生物類群。一些微生物如細(xì)菌、真菌和藻類等對重金屬離子都有很強(qiáng)的耐受性及吸附能力。本文著重研究從鎘污染的土壤中分離馴化耐鎘菌株，并進(jìn)行吸附試驗研究，進(jìn)一步選出兩株吸附效果最好的菌株，以期為土壤的鎘污染修復(fù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

土樣1:采自北京市某工廠車間土；

土樣2:采自北京市某工廠邊緣的土；

土樣1中鎘含量為2.13 mg·kg-1，土樣2中鎘含量為1.23 mg·kg-1，都超過了國家土壤環(huán)境質(zhì)量的三級標(biāo)準(zhǔn)值。具體的理化性質(zhì)見表1。

表1 土樣的理化性質(zhì)Table1 Soil physical and chemical properties

1.1.2 培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基:Na2SO42 g，K2HPO46 g，KH2PO45.5 g，KCl 2 g，MgSO47H2O 0.2 g，微量元素 1mL，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為7。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為 7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基:同牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，加瓊脂1.5%～2.0%。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集

采用五點法，取地下5～10 cm的土壤樣品混合，無菌袋帶回實驗室，風(fēng)干，研磨過篩，放-20℃冰箱里備用。

1.2.2 菌株的分離、馴化

分別稱取兩種風(fēng)干污染土1 g，放入盛有100mL無菌水并帶有玻璃珠的250mL的三角瓶中，28℃搖床振蕩30 min，使土樣與無菌水充分混合。取10mL菌液加入到90mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，再搖床振蕩培養(yǎng)5 d。靜置后取10mL培養(yǎng)液逐步轉(zhuǎn)接于Cd2+濃度分別為10、20、30、40、60 mg·L-1無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入葡萄糖為碳源、硝酸鉀為氮源。28℃搖床振蕩，每次培養(yǎng)7 d，進(jìn)行馴化。

1.2.3 菌株的純培養(yǎng)

把稀釋10-5倍的菌液涂布于牛肉膏固體培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)一段時間后形成單菌落。挑選長勢好、菌落飽滿的菌株用連續(xù)劃線法對細(xì)菌純化培養(yǎng)。

1.2.4 菌株的鑒定

以各單菌液為PCR的反應(yīng)模板，實驗采用的PCR反應(yīng)引物為16S rDNA細(xì)菌通用引物27F（正向引物）、1492R（反向引物）。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為聚合酶 50μL:2×TaqPCRmasterMix 25μL（0.1 U·μL-1Taq 聚合酶；500μmol·L-1dNTP；20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.3）；100 mmol·L-1KCl；3 mmol·L-1MgCl2），引物 27F（20 mmol·L-1）2μL，引 物 1492R（20μmol·L-1）2μL，模板 2μL，超純水 19μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性6 min，94℃變性30 s，52℃復(fù)性40 s，72℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（90 V，30 min），用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后測序，并將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用Blast進(jìn)行核苷酸同源性比較，初步鑒定其種屬。

1.2.5 菌株對鎘的吸附試驗

研究所篩選菌株對鎘的吸附能力，通過與污染土中土著微生物的吸附能力比較，選出吸附效果最好的菌株。

選用土樣1做吸附試驗。在無菌條件下將所篩選菌株分別接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基中，振蕩富集培養(yǎng)3 d，然后離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液多次洗滌，最后用無菌水配制成菌液。

取風(fēng)干并過篩的土樣3 g于100mL三角瓶中，分別加入菌液30mL，并用無菌水作對照，讓其在28℃下放置（培養(yǎng)）。15 d后把土樣自然風(fēng)干并研磨。

稱取0.1～0.3 g土樣，以HNO3為消解液，用微波消解儀進(jìn)行消解處理，然后用電感耦合等離子光譜儀測定土樣中鎘的含量。對照空白，計算吸附率。吸附率（%）＝（C0－C）/C0×100%。

1.2.6 菌株對鉛的吸附試驗

在土壤的重金屬污染中，鎘和鉛常常伴隨存在，為此對分離出的耐鎘菌株進(jìn)行對鉛的吸附能力研究。

原狀污染土樣1中鉛的含量為168 mg·kg-1。方法同對鎘的吸附試驗，計算吸附率。

1.2.7 pH和溫度對菌株生長的影響試驗

設(shè)定不同的pH和溫度對所篩選的耐鎘菌株進(jìn)行培養(yǎng)，觀察對菌生長量的影響。設(shè)pH分別為3、5、7、9、11；溫度分別為 10、20、25、30、40℃。確定菌的最佳生長溫度和pH值，然后再進(jìn)行培養(yǎng)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，繪制菌的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、馴化及純培養(yǎng)

通過每次轉(zhuǎn)接前對菌液進(jìn)行涂布發(fā)現(xiàn):隨著鎘濃度的增加，菌落的數(shù)量明顯減少。Cd2+濃度為60 mg·L-1時，選擇合適的稀釋濃度10-7涂布的培養(yǎng)基平板，對生長較好的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，得到14株形態(tài)各異的耐鎘細(xì)菌，其中從車間土中篩選出13株，分別標(biāo)記為Z1～Z13，工廠邊緣的土中篩選出1株，標(biāo)記為B1。劃線純化的菌形態(tài)如圖1所示。

圖1 菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strains on medium

2.2 菌株的鑒定

細(xì)菌的16S rDNA基因，在分子進(jìn)化中非常保守，在一定程度上反映細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生，因此，16S rDNA序列可用于微生物的鑒定及其分類地位的確定。以菌液為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物公司測序完成，得到的14株菌的基因序列在NCBI網(wǎng)站上用Blast進(jìn)行同源比對，查詢結(jié)果如表2所示。

表2 在GenBank中比對所得最大相似度菌株Table2 Cultured bacteria and their most closely matched species in GenBank

根據(jù)比對結(jié)果，計算每種屬所占的比例，得出所采污染土樣中對鎘有較強(qiáng)耐性的各細(xì)菌種屬所占比例如圖3所示，其中72%為銅綠假單胞菌，可知銅綠假單胞菌對鎘有較強(qiáng)的耐受性，屬于優(yōu)勢菌群。

圖2 土樣中微生物的組成Fig.2 Microbial community structure of soil sample

2.3 鎘和鉛的吸附試驗

測定土樣中鎘和鉛的含量，計算吸附率，結(jié)果如表3所示。

式中:C0-吸附前土樣中Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-）1；

C-吸附后土樣中 Cd2+/Pb2+的含量（mg·kg-1）。

由表3可知，與土樣中土著微生物相比，所篩選馴化出的14株菌對鎘和鉛都有一定的吸附效果，5、7、11、13號菌對鎘的吸附率比較高，都超過了40%，其Z13號菌對鎘的吸附率最高，達(dá)到47%，而Z11號菌對鉛的吸附率最高，也達(dá)到了47%。由于土壤中的重金屬污染，鎘和鉛常常伴隨存在，所以11和13號菌對鎘和鉛復(fù)合污染土壤的修復(fù)更具有實用價值。對這兩株進(jìn)行生物學(xué)特性研究。

表3 菌株對鎘和鉛的吸附結(jié)果Table3 Results of adsorption of Cd2+and Pb2+by strains

2.4 pH和溫度對菌株生長的影響

2.4.1 溫度對菌株生長的影響

結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對菌Z11和Z13生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of strain Z11 and Z13

如圖3所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，Z11和Z13生長量逐漸增大，在20～25℃下生長量達(dá)到最大值，繼續(xù)提高溫度，生長量逐漸下降，說明兩菌株都不能耐高溫。

2.4.2 pH對菌株生長的影響

結(jié)果見圖4。

圖4 pH對菌株Z11、Z13生長的影響Fig.4 Effect of pH on growth of strain Z11 and Z13

如圖4所示，Z11菌能夠在pH值為5～9范圍內(nèi)生長，對外界酸堿性的變化具有較強(qiáng)的耐受性，最適生長pH為7～9；Z13菌最適生長pH為5～7，在堿性條件下幾乎不能生存，在偏酸環(huán)境下，生長良好。兩株菌在pH為7時生長都較好。

2.4.3 最佳生長條件下菌的生長曲線

在最佳生長溫度25℃，pH 7時培養(yǎng)菌，用722分光光度計比色法（波長為600nm）測定不同培養(yǎng)時間（3、6、9、12、18、24、30、38、48、60、72 h）細(xì)菌懸浮液的OD600值。生長曲線見圖5。

由圖5可知，菌株Z11在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入生長對數(shù)期，在30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在38 h時達(dá)到生長最高峰，48 h后進(jìn)入衰亡期；Z13是培養(yǎng)9 h后進(jìn)入生長對數(shù)期，在30 h時達(dá)到生長高峰期，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，60 h后進(jìn)入衰亡期，同一時刻測定的OD600值總體反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。

圖5 菌株Z11、Z13的生長曲線Fig.5 Growth curve of strains Z11 and Z13

3 討論

a.鎘不僅是微生物生長代謝過程中的必需元素，而且是毒性非常大的重金屬，微量的鎘都會對微生物產(chǎn)生毒害，但在受鎘污染的土壤中，微生物由于長期遭受重金屬的脅迫，具有了抵抗毒害的能力。為了進(jìn)一步獲得對鎘有較高耐性的微生物，本試驗通過馴化培養(yǎng)，逐步提高重金屬離子的濃度，以提高微生物對重金屬的耐受性，經(jīng)多代傳種而獲得目的菌株。最后從鎘含量超標(biāo)的樣土中共篩選馴化出14株耐鎘的細(xì)菌。

b.通過與污染土中土著微生物的吸附能力比較，研究所篩選菌株對鎘的吸附能力。由結(jié)果可知與土樣中土著微生物相比，所篩選馴化出的14株菌對鎘都有一定的吸附效果，其中Z13號菌對鎘的吸附率最高，達(dá)到47%。

菌株最終要應(yīng)用于土壤重金屬污染的治理，而在現(xiàn)實土壤的重金屬污染中，鎘和鉛常常伴隨存在，為此對分離出的耐鎘細(xì)菌進(jìn)行對鉛的吸附能力研究。結(jié)果表明14株耐鎘細(xì)菌對鉛也有一定的吸附效果，其Z11號菌對鉛的吸附率最高，達(dá)到了47%。Z11和Z13菌對重金屬污染土壤的修復(fù)更具有實用價值。

從生物吸附角度看，細(xì)菌對金屬離子的吸附不僅與細(xì)胞活性、表面結(jié)構(gòu)、組成及細(xì)胞的新陳代謝過程有關(guān)，還有多數(shù)研究認(rèn)為細(xì)菌對鎘的耐性與質(zhì)粒存在有關(guān)，有關(guān)耐鎘細(xì)菌細(xì)胞吸附鎘的機(jī)理還有待進(jìn)一步論證。

c.通過吸附試驗研究，最終選定菌株Z11和Z13進(jìn)行后續(xù)強(qiáng)化龍葵吸收重金屬鎘的試驗。所以本試驗只研究了這兩株菌的生長環(huán)境因素。結(jié)果表明兩株菌都不能耐高溫。由于土壤中溫度變化不大，所以對菌株的實際應(yīng)用沒有影響。菌Z11對外界酸堿性的變化具有較強(qiáng)的耐受性，而菌Z13在偏酸的條件下生長較好。菌株對環(huán)境和土壤條件的適應(yīng)性越強(qiáng)其應(yīng)用價值越高。

4 結(jié)論

本試驗從鎘含量超標(biāo)的樣土中共馴化出14株耐鎘的菌株。經(jīng)過16S rDNA序列分析，初步鑒定出種屬，分析菌群結(jié)構(gòu)，可知銅綠假單胞菌占72%，屬于優(yōu)勢菌群。同時對耐鎘菌株分別進(jìn)行鎘和鉛的吸附試驗研究，選取吸附鎘和鉛效果最好的兩株菌，菌Z11對鎘和鉛的吸附率分別達(dá)到40%和47%，菌Z13是47%和33%。對兩株菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究可知，它們在20～25℃下生長量達(dá)到最大值，都不能耐高溫。Z11最適生長pH為7～9，Z13菌最適生長pH值為5～7，Z11對外界酸堿性的變化具有較強(qiáng)的耐受性，Z13在偏酸的條件下生長較好。在最佳生長條件溫度為25℃，pH為7時繪制出兩株菌的生長曲線，同一時刻測定的OD600值總體反映出菌株Z13的生物量高于菌株Z11。本研究為鎘污染土壤的微生物修復(fù)提供一定的試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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