秦俊哲， 張慧洋

(陜西科技大學生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 前 言

桑黃，又名鮑氏層孔菌Phellinusigniarius，是目前發(fā)現的生物抗癌領域有效率高的大型真菌[1]，因其特有的藥用價值，已成為國內外抗癌藥物研究的熱點.由于生長環(huán)境的特殊性，野生桑黃在自然界中生長較困難，產量少，無法滿足市場需求，故只能借助于液體培養(yǎng)來獲得大量菌絲球，國內桑黃的液體培養(yǎng)大都處于實驗室搖瓶培養(yǎng)階段，有關發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)也鮮有報道.本文通過在線檢測并對比桑黃搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)各指標不同階段的變化，旨在進一步研究桑黃菌的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，為桑黃的大規(guī)模生產提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌種.桑黃：陜西科技大學微生物菌種室提供.

(2)培養(yǎng)基.PDA綜合培養(yǎng)基[2]；種子培養(yǎng)基：玉米粉4%，麩皮2.4%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB1、VB2各10 mg;發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉2.66%，麩皮2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB1、VB2各20 mg.

(3)儀器設備.HYG-IIa迂轉式恒溫調速搖瓶柜、BIOF-6010S型發(fā)酵罐、756PC紫外可見分光光度計、LS-C50L型立式壓力蒸汽滅菌器等.

1.2 方法

(1)菌種的活化.將母種接種到PDA綜合培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)10 d.

(2)搖瓶培養(yǎng).50 mL種子培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，接入4塊活化好的0.5 cm2桑黃菌塊，于28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d，得種子液；將150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500 mL三角瓶中，接入10%的種子液，于28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)1 d，每隔24 h，隨機取兩個搖瓶，檢測各項生理指標，得搖瓶培養(yǎng)變化規(guī)律.

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng).將5 L料液裝入10 L發(fā)酵罐中，接入10%發(fā)酵液，常壓下，于28 ℃、攪拌速度200 r/min、通氣量1∶1(v/v)條件下培養(yǎng)，通過不斷加水，使罐中水位維持在同一水平，每隔24 h取樣，檢測各項生理指標，得發(fā)酵罐培養(yǎng)變化規(guī)律.

(4)測定項目及方法.菌絲干重：過濾發(fā)酵液得菌絲，沖洗至洗出液澄清無色，65 ℃烘至恒重，稱重，3次取平均值.pH值：pH計測；DO：通過安裝在發(fā)酵罐上的電極在線測量；還原糖含量：DNS法[3]；氨基態(tài)氮：甲醛滴定法(GB/T 12143.2-89).

2 結果與分析

2.1 桑黃的搖瓶培養(yǎng)

圖1 搖瓶培養(yǎng)中菌絲干重及發(fā)酵液中還原糖的變化

(1)搖瓶培養(yǎng)中菌絲體干重及發(fā)酵液中還原糖變化.由圖1知，桑黃在搖瓶中的生長規(guī)律為：0～72 h為適應期;72～168 h為對數生長期；168～216 h為穩(wěn)定期.基質中還原糖含量變化隨桑黃的生長呈“弓”形變化趨勢，0～120 h由于桑黃生長較慢，耗糖量也較少，且桑黃分泌的各種酶降解培養(yǎng)基中的淀粉及多糖類物質，使還原糖含量上升[4];120 h時還原糖含量達到最高，之后隨菌體量的增加，耗糖量也在增加，故還原糖含量呈下降趨勢.

(2)發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量及pH值變化.如圖2所示，菌體在生長過程中具有自身調節(jié)功能，將pH值逐漸調節(jié)向其自身生理生長適宜的范圍移動.在培養(yǎng)初期，氨基酸含量緩慢上升，pH則越來越?。浑S著菌絲的大量生長繁殖，氨基酸被菌體利用，其含量又不斷下降，pH開始緩慢上升；末期，氨基酸的含量又會處于緩慢狀態(tài)，此時pH值穩(wěn)定在5.5左右.氨基酸態(tài)氮含量變化與蔣麗等[5]對猴頭菌深層發(fā)酵的研究結果有相似的情形.

圖2 發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量及pH值的變化 圖3 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程中菌絲干重及還原糖的變化

2.2 桑黃的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

(1)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程中菌絲干重及發(fā)酵液中還原糖的變化.由圖1和圖3可以看出，兩條生長曲線類似，但也存在一定的差異：首先，搖瓶培養(yǎng)的對數期較發(fā)酵罐培養(yǎng)的長，這與兩者的環(huán)境不同有很大的關系；另外，從菌絲體產量來看，發(fā)酵罐培養(yǎng)要比搖瓶培養(yǎng)高得多，主要因為發(fā)酵罐采用直接通入空氣供氧，加上攪拌器的充分攪拌，使發(fā)酵罐中的溶氧更加充足，菌絲體才能夠更充分的生長，發(fā)酵罐培養(yǎng)產量可達19.86 g/L.放罐時機應該選擇在穩(wěn)定期，此時菌絲量最大，且菌絲體尚未開始自溶，故選擇120 h時放罐.隨著發(fā)酵罐中菌絲體的大量繁殖，發(fā)酵液中還原糖含量迅速下降.

(2)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程中氨基態(tài)氮含量及pH的變化.由圖4知，發(fā)酵前期，氨基態(tài)氮變化不大，只是略有下降，說明此時培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質只有少量被消耗，但在發(fā)酵中期,隨著還原糖的急劇下降，氨基態(tài)氮也呈現下降趨勢，只是幅度要比還原糖小，這是菌絲體不斷生長消耗營養(yǎng)物質的緣故，120 h后氨基態(tài)氮濃度稍有回升，可能是由于菌絲體開始老化自溶，釋放出的內容物使氨基氮含量增加[6]；而pH在整個發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中是呈穩(wěn)定下降趨勢的，最終穩(wěn)定在5.5左右，表明發(fā)酵過程有酸性物質生成，結合發(fā)酵罐生長曲線，可以確定發(fā)酵最佳pH值為5.5.

圖4 發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中氨基態(tài)氮含量及pH的變化 圖5 發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中DO的變化

(3)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程中DO的變化.DO是發(fā)酵罐生產中的一個重要參數，由圖5知，起初DO緩慢下降，是由于菌絲體處于適應期，生長緩慢，耗氧少，24 h后DO迅速下降，此時菌絲體大量繁殖，發(fā)酵90 h時DO達到最小值，120 h以后DO又有所回升，此時的菌絲體開始老化自溶，幾乎不再需要氧氣.發(fā)酵過程中DO最小為45%左右，說明整個過程溶解氧充足[7].

3 結束語

通過在線檢測并對比桑黃搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)的各項動態(tài)指標，可以得出以下結論：搖瓶培養(yǎng)在10%接種量、28 ℃、160 r/min的條件下，菌絲量在144 h可達到最大，還原糖含量在120 h最高，氨基態(tài)氮在72 h達到最大，最適桑黃生長的pH值為5.5；發(fā)酵罐培養(yǎng)在5 L裝液量、10%接種量，罐壓常壓，200 r/min攪拌速度、通氣量1:1(v/v)、溶氧充足的條件下，120 h可以達到最大菌絲體量，此時也是放罐的最佳時刻，還原糖和氨基態(tài)氮隨桑黃的生長而不斷減少，最適發(fā)酵pH值為5.5，這個同搖瓶培養(yǎng)得出的結論是一樣的.

參考文獻

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[2] 孔祥君，王澤生．中國蘑菇生產[M]．北京：中國農業(yè)出版社，2000：53-60.

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[4] 樂超根，邵 偉．我國食用菌液體發(fā)酵進展及其綜合利用[J]．湖北二峽學院學報，1997，19(3)：97-101.

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[6] Ajith,A;Janardhanan,K.K.Cytotoxic and antitumor activities of a polypore macrofungus，Phellinusrimosus(Berk) Pilat [J].J Ethnopharmacol，2003，84(2)：157-162.

[7] 顧雅君，王 瑛，劉建榮，等．與食用菌相關主要酶的研究和應用[J].中國食用菌，2006，25(1)：40-42.