蔡蘭芬 王寶杰 王洪波 翟 靜 常維山

（①山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 濰坊 261061 ②濟南深藍動物保健品有限公司③泰山醫(yī)學院 ④山東農(nóng)業(yè)大學 泰安）

紫草活性成分的分離制備研究

蔡蘭芬①王寶杰①王洪波②翟 靜③常維山④*

（①山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 濰坊 261061 ②濟南深藍動物保健品有限公司③泰山醫(yī)學院 ④山東農(nóng)業(yè)大學 泰安）

本研究建立了高速逆流色譜分離制備紫草中的有效成分β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素和異丁酰紫草素的新方法，溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)，上相為固定相，下相為流動相。從150mg紫草的超臨界提取物中制備得到17.6mg β-羥基異戊酰紫草素(純度96.7%,)、17.6mg乙酰紫草素(純度99.3%)和19.7mg異丁酰紫草素(純度95.5%)。純度經(jīng)高效液相色譜分析，其化學結構由核磁共振1H NMR和13C NMR鑒定。

高速逆流色譜 紫草 成分 制備

*通訊作者

泰山紫草，為紫草屬紫草科植物紫草Lithospermum erythorhizon sieb.et zucc.的根。紫草常被用來治療燒傷、燙傷和各種皮膚病，其有效成分為各種蒽醌類物質?，F(xiàn)代藥理表明，紫草還具有具有抗炎、抗菌、抗病毒、及抗腫瘤的作用[1-11]。高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography， HSCCC)是一種不用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜新技術，目前已廣泛應用于生物工程、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學、有機合成、環(huán)境分析、食品及地質材料等領域。我國是最早開展HSCCC研究的國家之一，已利用HSCCC建立了多種中藥有效成分的分離方法[12-18]。

本試驗利用高速逆流色譜儀分離、純化、制備了泰山紫草超臨界萃物中的三種蒽醌類化合物：β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素和異丁酰紫草素。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 TBE-300A高速逆流色譜儀(中國上海同田生化技術有限公司)；?KTA prime泵及檢測系統(tǒng)(瑞士安瑪西亞生物有限公司)；HX-1050恒溫器(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；色譜柱：SPHERIGELODS C18(250 mm×4. 6mm, .i d. 5μm)；Mercury plus400核磁共振儀(美國瓦里安公司)。泰山紫草藥材采集自泰山，經(jīng)專家鑒定為道地藥材；用于粗提物的制備及HSCCC分離的溶劑均為分析純(濟南試劑總廠)；HPLC分析用甲醇為色譜純(禹城化工廠)；實驗用水為二次去離子水。

1.2 樣品制備 紫草藥材300克粉碎至顆粒60～80目。超臨界萃取條件：萃取釜壓力25MPa，溫度45℃；分離釜的溫度和壓力分別為35℃和6 MPa ；CO2流量為40L/h，時間2.5h。

1.3 兩相溶劑系統(tǒng)的制備及分配系數(shù)的測定 HSCCC溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，按比例配制于分液漏斗中并劇烈振蕩，體系分相平衡后分離出上下相，分別超聲脫氣30min備用。分別取上相和下相各2ml，加入粗提物0.1mg，劇烈振蕩5分鐘后分別取上下相進液相色譜進行分析。目標組分在下相與上相中的濃度之比即為分配系數(shù)，根據(jù)分配系數(shù)選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)。

1.4 HSCCC分離過程：取150mg紫草粗提物，加入4ml上相，振蕩使之完全溶解，以備HSCCC分離。將石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)的上相(固定相)與下相(流動相)以55:45的體積比泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，待螺旋管完全充滿后，以800r/min的速度旋轉，同時以2.0 ml/min的流速泵入下相。分離溫度由恒溫器控制在20℃。當體系達到流體動力學平衡后，將樣品由進樣閥注入分離管路。柱后流出物以紫外檢測器檢測，檢測波長為254 nm。根據(jù)色譜圖手動收集各色譜峰組分。

1.5 HPLC分析及結構鑒定 紫草超臨界提取物和HSCCC峰組分用HPLC進行分析。色譜柱：SPHERIGELODS C18 (250mm×4.6mm.id.5mm)；流動相：乙腈:水70:30，流速為1ml/min；檢測波長：254nm；柱溫：室溫；進樣量：20μl。

HSCCC各峰組分的結構根據(jù)1H NMR和13C NMR的數(shù)據(jù)進行鑒定。

2 結果

2.1 CO2超臨界萃取收率 得到萃取物6.9g，萃取率為2.3%。

2.2 HPLC條件優(yōu)化 研究了以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-1%乙酸等作為HPLC流動相時，紫草超臨界萃取物中各組分的分離效果。結果表明：當采用乙腈-水70:30，流動相流速為1ml/min時，可取得良好的分離效果。

2.3 HSCCC分離條件的優(yōu)化 采用HPLC測定了目標組分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)(表1、圖1)。在本試驗中，選用的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系。采用體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)時，紫草中的組分得到良好的分離。同時，對流動相流速、旋轉管轉速、分離溫度等也進行了優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)：在流速為2ml/min，轉速為800r/min，溫度為20℃時，分離結果令人滿意。

表1 各目標組分在石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的分配系數(shù)

由表1可以看出，分離體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)時，分配系數(shù)在0.92與3.03之間，屬最佳分離體系。

圖1 紫草粗提物的高速逆流色譜圖

由圖1可以看出，利用分離體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:8:2，V/V)，可從紫草萃取物中分離出3種組分，即峰I、峰 II、峰III。

2.4 HSCCC峰組分的鑒定 利用核磁共振，根據(jù)1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)對HSCCC目標峰組分進行鑒定：按照參考文獻[19], 峰I鑒定為β-羥基異戊酰紫草素；峰II鑒定為乙酰紫草素；按照參考文獻[20]，峰III鑒定為異丁酰紫草素。

2.5 HSCCC分離純化收率 在優(yōu)化條件下，對紫草的超臨界提取物進行了HSCCC分離純化，從150 mg粗提物中可一次性得到17.6 mg β-羥基異戊酰紫草素、17.6mg乙酰紫草素和19.7 mg異丁酰紫草素.

3 討論

乙酰紫草素等是紫草的主要有效成分[20]。本文建立了利用CO2超臨界萃取泰山紫草有效物質的方法。萃取率可達2.3%。利用高速逆流色儀對泰山紫草蒽醌類活性成分進行了純化制備，提純了三種有效成分，經(jīng)核磁共振分析，此三種成分分別是β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素和異丁酰紫草素。

據(jù)報道紫草對京科68-1病毒在體外有抑制作用，紫草素在雞胚中能抑制流感病毒，在組織培養(yǎng)中能延緩脊髓灰質炎病毒的致細胞病變作用，紫草對乙型肝炎抗原(HBsAg)有抑制免疫反應作用；紫草對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌和綠膿桿菌有抑制作用；紫草的10%的生理鹽水浸液對絮狀表皮癬菌、羊毛狀小芽胞癬菌等真菌有抑制作用。紫草水煎液對小白鼠結核病有一定療效。楊榮[21]對軟紫草、黃花軟紫草、紫草、滇紫草、露蕊滇紫草、密花滇紫草6品種進行體外抑菌實驗,表明：各紫草水、醇提液對金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。趙清科等[22]人用炒紫草粉敷于皰疹上治療帶狀皰疹總有效率97.4%，且愈后無感染及并發(fā)癥。上述資料表明，泰山紫草是一種很有開發(fā)前景的抗感染中草藥。

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