頓愛社,張春菊,呂伯實,劉 帥,侯海峰,呂方啟

(1泰山醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271000;2泰安衛(wèi)生學(xué)校基礎(chǔ)護(hù)理教研室; 3泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

蟾酥是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,蟾酥膠囊(CC)是重慶市中醫(yī)研究院研制的以蟾酥為主要成分的一種蟾酥制劑,動物實驗和臨床報告表明,蟾酥提取物及各種蟾酥制劑具有治療肝癌的作用[1,2],而利用血清藥理學(xué)方法研究蟾酥制劑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并探討其誘導(dǎo)機制的報道甚少。近兩年,我們采用血清藥理學(xué)方法,觀察CC血清對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株BEL-7402凋亡的誘導(dǎo)作用,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及主要試劑人肝癌細(xì)胞株 BEL-7402購自華西臨床醫(yī)學(xué)院移植與免疫實驗室,CC水溶液由重慶市中醫(yī)研究院提供;純種新西蘭大白兔由華西實驗動物中心提供。培養(yǎng)基RPMI-1640,碘化丙啶(PI),MTT,二甲基亞砜(DMSO)。兔抗人Bcl-2單克隆抗體,SABC免疫組化SABC試劑盒,DNA提取試劑盒。

1.2 含藥血清的制備 參考文獻(xiàn)[3]的方法并作改進(jìn)。20只新西蘭大白兔(體質(zhì)量2.0～2.5 kg)隨機分為兩組,各 10只,分別用于制備含藥血清和無藥血清。前者給予CC水溶液灌胃6ml/(kg?d),后者給予以等量NS灌胃,均3 d,兩組均自由進(jìn)食和飲水。末次灌胃 1 h后,心臟穿刺抽血,4℃冰箱過夜,離心,無菌分離血清,滅活,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 BEL-7402用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),至對數(shù)生長期,消化收集,分別加入無藥血清(對照組),含10%(實驗1組)、20%(實驗2組)、30%(實驗3組)CC血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸調(diào)整,以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶,分別培養(yǎng) 24、48 h備測。

1.4 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞抑制率、凋亡率測算 采用倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況,用MTT比色法測算各組細(xì)胞抑制率[4],用流式細(xì)胞術(shù)測算細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1.5 各組細(xì)胞DNA梯度條帶測定 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。取PBS洗過的BEL-7402(1×106),按試劑盒說明書抽提細(xì)胞中DNA,1.5%瓊脂糖凝膠、100 V恒壓電泳,紫外燈下觀察DNA條帶,用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6 各組細(xì)胞Bcl-2檢測 采用免疫組化SABC法染色,按試劑盒說明書操作。用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對Bcl-2染色結(jié)果進(jìn)行定量分析,測定其吸光值(A值)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示,組間比較采用t檢驗和方差分析,兩兩比較用LSD法。α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 ①細(xì)胞貼壁能力變化：誘導(dǎo)培養(yǎng) 24 h時,實驗 2組細(xì)胞貼壁能力明顯下降,部分細(xì)胞呈漂浮生長狀態(tài),實驗 1、3組細(xì)胞貼壁能力未見明顯變化;48 h時,實驗2組細(xì)胞貼壁能力進(jìn)一步下降,大部分細(xì)胞呈懸浮生長,實驗 1、3組細(xì)胞貼壁能力有所下降,少許細(xì)胞呈懸浮生長。②細(xì)胞集落性的變化：誘導(dǎo)培養(yǎng) 24 h,實驗 2組細(xì)胞集落生長特性明顯降低,部分細(xì)胞呈單個生長狀態(tài),實驗1、3組細(xì)胞集落生長特性無明顯變化;48 h時,實驗1組細(xì)胞集落生長特性無明顯變化,實驗 2組大部分細(xì)胞、實驗 3組有少許細(xì)胞呈單個生長狀態(tài)。③細(xì)胞大小和形狀變化：誘導(dǎo)培養(yǎng) 24 h,實驗2組大多數(shù)細(xì)胞仍呈梭形,個別細(xì)胞變小、變圓,實驗 1、3組細(xì)胞大小與形狀未見明顯變化;48 h時,實驗1組細(xì)胞大小、形狀仍未見明顯變化,實驗 2組大部分細(xì)胞和實驗 3組少部分細(xì)胞變小、變圓。對照組細(xì)胞培養(yǎng) 24 h時呈集落性、貼壁生長,長梭形,胞質(zhì)飽滿,折光性強;48 h后,相鄰細(xì)胞生長匯合成片,逐漸形成細(xì)胞單層,細(xì)胞貼壁能力無明顯下降,無細(xì)胞脫落。

2.2 各組細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞周期及凋亡率比較見表1。

表1 各組細(xì)胞生長抑制率、凋亡率及細(xì)胞周期(±s)

表1 各組細(xì)胞生長抑制率、凋亡率及細(xì)胞周期(±s)

注：與對照組同時點比較,＊P＜0.05,△P＜0.01

組別 細(xì)胞生長抑制率(%)細(xì)胞凋亡率(%)細(xì)胞周期(%) G1期 S期 G2/M期對照組24 h 0 3.3±0.45 55.8 33.6 10.6 48 h 0 4.3±0.22 54.6 29.9 15.4實驗1組24 h 10.3±0.17＊10.5±0.22＊54.3 33.2 12.5＊48 h 13.6±0.14＊14.6±0.41＊44.1＊ 26.6 29.3＊實驗2組24 h 26.5±0.25△32.6±0.51△50.6 31.0 18.4＊48 h 30.2±0.28△38.5±0.45△40.4＊ 27.7 31.8＊實驗3組24 h 15.6±0.24＊13.3±0.32＊53.3 32.4 14.3＊48 h 18.4±0.16＊23.6±0.54＊43.5＊ 28.4 28.0＊

2.3 各組細(xì)胞DNA電泳結(jié)果 對照組未見DNA階梯狀電泳條帶,各實驗組均見典型的DNA階梯狀電泳條帶(詳見圖1)。

圖1 凋亡細(xì)胞DNA含量電泳分析

2.4 各組Bcl-2表達(dá)結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)24 h時,對照組及實驗1、2、3組Bcl-2 A值分別為0.80±0.03、0.44±0.03、0.35±0.05、0.42±0.04;48 h時分別為0.75±0.03、0.40±0.04、0.30±0.03、0.32± 0.02。各實驗組Bcl-2 A值均低于對照組(P均＜0.05),與實驗1、3組比較,實驗2組48 h時Bcl-2 A值最低(P均＜0.05)。

3 討論

血清藥理學(xué)由日本學(xué)者田代真一在 1984年首屆和漢醫(yī)藥學(xué)會上首次提出[5]。指將單味或復(fù)方中藥制劑經(jīng)口灌胃給動物一定時間后,采集動物血液,分離血清,用此含藥血清進(jìn)行體外實驗的方法,從機理上更接近口服中藥后體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程,克服了中藥粗制劑在細(xì)胞藥理實驗上的缺點,提高了實驗結(jié)果的科學(xué)性。

有研究證實[6～11],原癌基因 Bcl-2是重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因,在抑制細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用,可以增強細(xì)胞的存活力,參與細(xì)胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控,Bcl-2異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),各實驗組 BEL-7402與含CC血清共同孵育后,出現(xiàn)了一系列凋亡細(xì)胞的生物學(xué)特征[12],如細(xì)胞變小、變圓,細(xì)胞膜完整但有發(fā)泡現(xiàn)象等;各實驗組細(xì)胞生長抑制率和凋亡率均較對照組明顯升高,提示含 CC血清可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),G1、S期細(xì)胞減少, G2/M期細(xì)胞增多;細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào),提示含CC血清誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制可能是使處于分裂活躍階段的S期細(xì)胞減少,使細(xì)胞阻滯于 G2/M期,阻止細(xì)胞進(jìn)入下一個分裂周期,抑制細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致細(xì)胞生長受抑制。含CC血清誘導(dǎo)BEL-7402凋亡的機制可能與下調(diào)細(xì)胞 Bcl-2表達(dá)有關(guān),這與Green等[13]研究結(jié)果一致。

本研究中,各實驗組細(xì)胞凋亡率均高于對照組,且各實驗組之間比較,誘導(dǎo)48 h時較24 h的細(xì)胞凋亡率高,以實驗 2組在誘導(dǎo) 48 h的細(xì)胞凋亡率最高。分析原因可能是細(xì)胞凋亡率并非一定隨藥物濃度及作用時間增加而增加,在藥物濃度達(dá)到一定量、且作用一定時間后,細(xì)胞開始凋亡,凋亡率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高;開始時細(xì)胞凋亡率與藥物劑量呈正相關(guān)關(guān)系;但藥物達(dá)到一定劑量后細(xì)胞凋亡率不再增加,需等到其他周期的細(xì)胞過渡到該周期才有可能被誘發(fā)凋亡而繼續(xù)發(fā)揮其藥物作用。因此我們推測,含 CC血清的最佳濃度應(yīng)該在20%左右。

總之,CC血清具有良好的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡的作用,其有望作為一種新的治療肝癌藥物,但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機制、是否引起肝癌細(xì)胞耐藥及臨床應(yīng)用劑量和療效方面尚不十分清楚,有待于進(jìn)一步研究。

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