唐曉磊,何素輝,梁曉東,陳章權(quán)

(廣東醫(yī)學(xué)院,廣東東莞 523808)

肥大細(xì)胞類(lèi)糜蛋白酶(MC-Chy)是肥大細(xì)胞中一種重要的炎癥介質(zhì),近年來(lái)研究表明它在變態(tài)反應(yīng)性疾病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、肺纖維化等疾病發(fā)生發(fā)展中的起著重要的病理生理作用[1,2],國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少。由于分離純化天然的MC-Chy極為困難,為獲取分泌表達(dá)的重組MC-Chy,進(jìn)一步深入研究MC-Chy的免疫病理作用,2009年10月～2010年3月,我們進(jìn)行了MC-Chy分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品, DNA凝膠回收與質(zhì)粒抽提試劑盒為QiaGen公司產(chǎn)品,Kpn I、Xho I限制性?xún)?nèi)切酶和T4 DNA連接酶為T(mén)akara公司產(chǎn)品,pcDNA3.1表達(dá)載體、含肥大細(xì)胞類(lèi)糜蛋白酶基因的質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α由本研究室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中人MC-Chy的編碼序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),用人免疫球蛋白 κ鏈的信號(hào)肽編碼序列置換人MC-Chy自身的信號(hào)肽序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,即P1：5′-GGTACCATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTA CTCTGGCT CCCAGACACCACTGGAGAAGAGATCATCGGGGGCA CAGAATGC-3′(下劃?rùn)M線為KpnⅠ酶切位點(diǎn),下劃波浪線為人免疫球蛋白κ鏈信號(hào)肽編碼序列);P 2：5′-CTCGAGTTAATTTGCCTGCAGGATCTGGTT-3′(下劃?rùn)M線為Xho I酶切位點(diǎn))。

1.2.2 基因擴(kuò)增 以本研究室制備含MC-Chy基因的質(zhì)粒pDEST17/CMA[3]為模板,用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃變性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸 30 s,30個(gè)循環(huán)后,72℃延伸 45 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化,將純化的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,轉(zhuǎn)化菌液涂布于含100μg/ml氨芐青霉素(Amp)丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的Luria-Bertani(LB)平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單個(gè)白色菌落進(jìn)行培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,以KpnⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定,并選取陽(yáng)性克隆DNA測(cè)序,用Blast軟件進(jìn)行DNA序列同源性分析,陽(yáng)性克隆命名為pGEM-T/Chy。

1.2.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒pGEM-T/ Chy和pcDNA3.1分別用KpnⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,并分別純化回收目的片段?；厥债a(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH 5α,轉(zhuǎn)化菌液涂布于含Amp(100μg/ml)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,用PCR與Kpn I、Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定后,將陽(yáng)性克隆進(jìn)行 DNA測(cè)序鑒定,陽(yáng)性克隆命名為pcDNA3.1/Chy。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,見(jiàn)有1條約750 bp的條帶(見(jiàn)圖1),與預(yù)期結(jié)果相符?？寺∪雙GEM-T載體,經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切,電泳分析顯示切下約750 bp的DNA片段(見(jiàn)圖2),DNA測(cè)序結(jié)果表明,插入了687 bp的Chy基因,在其上游成功連接了60 bp的人免疫球蛋白 κ鏈信號(hào)肽基因,閱讀框正確,同源性分析顯示插入的人MC-Chy編碼區(qū)基因與Gen-Bank中的DNA序列一致。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定結(jié)果 經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切從pGEM-T/Chy切下目的片段,純化、回收后與經(jīng)同樣雙酶切回收的pcDNA3.1片段相連接,構(gòu)建pcDNA3.1/Chy質(zhì)粒。挑取5個(gè)菌落,PCR鑒定出2個(gè)陽(yáng)性克隆(見(jiàn)圖3),進(jìn)一步Kpn I和Xho I雙酶切鑒定顯示切下約750 bp的DNA片段,與預(yù)期結(jié)果相符。DNA測(cè)序結(jié)果表明目的片段正確插入表達(dá)載體pcDNA3.1。Blast同源性分析顯示,目的基因及連接在其上游的信號(hào)肽基因無(wú)突變,閱讀框正確,可用于進(jìn)一步的重組表達(dá)。

3 討論

肥大細(xì)胞存在于機(jī)體的許多組織中,具有許多生物功能,不僅在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,也在變態(tài)反應(yīng)性疾病、炎癥、心血管疾病、腫瘤等發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的免疫病理作用[1,4,5]。其作用是通過(guò)細(xì)胞活化脫顆粒、釋放炎癥介質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。其炎癥介質(zhì)分為預(yù)先合成介質(zhì)和新合成介質(zhì),其中預(yù)先合成介質(zhì)以組胺和中性蛋白酶等為主,肥大細(xì)胞中性蛋白酶主要包括肥大細(xì)胞羧肽酶、類(lèi)胰蛋白酶和類(lèi)糜蛋白酶等[1],這些中性蛋白酶與肝素緊密結(jié)合成大分子混合物儲(chǔ)藏于肥大細(xì)胞顆粒內(nèi),隨著肥大細(xì)胞的活化釋放出細(xì)胞外發(fā)揮作用。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pGEM-T/Chy酶切鑒定結(jié)果

圖3 pcDNA 3.1/Chy重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

MC-Chy國(guó)外研究較多,國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究報(bào)道較少。目前的研究表明MC-Chy具有增加微血管的通透性和引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、刺激成纖維細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管生成、刺激膠原蛋白的合成并促進(jìn)纖維化的形成等作用[1,4～6]。因此,其在哮喘、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、肺纖維化等疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,是變態(tài)反應(yīng)性疾病和心血管疾病的一個(gè)新治療靶點(diǎn)[2]。肥大細(xì)胞活化產(chǎn)生介質(zhì)具有多樣性,甚至產(chǎn)生生化作用相反的介質(zhì),其中MC-Chy就有類(lèi)似性質(zhì),它能水解血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ,而同樣屬于中性蛋白酶的肥大細(xì)胞羧肽酶則能水解血管緊張素Ⅱ,生成生物學(xué)作用與其相反的血管緊張素1-7[7],MC-Chy能水解大分子內(nèi)皮素生成具有高度縮血管活性的內(nèi)皮素 1[8],而肥大細(xì)胞羧肽酶則能降解內(nèi)皮素 1[9]。目前僅了解這些肥大細(xì)胞中性蛋白酶的生物學(xué)活性,但對(duì)于它們?cè)谙嚓P(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚不清楚。

天然的肥大細(xì)胞中性蛋白酶分離純化以及純化后酶活性的保存均非常困難。因此,我們擬用重組蛋白進(jìn)行相關(guān)研究。MC-Chy屬于預(yù)先合成的介質(zhì),存在于肥大細(xì)胞胞質(zhì)顆粒中,它本身含有信號(hào)肽,當(dāng)細(xì)胞活化后才能釋放至細(xì)胞外。在進(jìn)行重組蛋白制備時(shí),若保留其本身信號(hào)肽,重組蛋白能否分泌出細(xì)胞外迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。為使產(chǎn)物分泌后表達(dá),本實(shí)驗(yàn)選擇高效分泌表達(dá)的免疫球蛋白 κ鏈信號(hào)肽與成熟MC-Chy基因融合,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取融合有免疫球蛋白κ鏈信號(hào)肽的MC-Chy基因片段,通過(guò)酶切連接插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,成功構(gòu)建了人MC-Chy分泌型真核表達(dá)載體。此前我們成功構(gòu)建了人肥大細(xì)胞羧肽酶分泌型真核表達(dá)載體,這些工作的完成為重組肥大細(xì)胞羧肽酶與MC-Chy的制備及探討二者在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Pejler G,R?nnberg E,Waern I,et al.Mastcell proteases-multifaceted regulators of inflammatory disease[J].Blood,2010,115 (24)：4981-4990.

[2]Bacani C,Frishman WH.Chymase：a new pharmacologic target in cardiovascular disease[J].Cardiol Rev,2006,14(4)：187-193.

[3]陳章權(quán),黃震,何天文,等.人肥大細(xì)胞類(lèi)糜蛋白酶基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備與鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2007,23(11)：1025-1027.

[4]Kovanen PT.Mast cells：multipotent local effector cells in atherothrombosis[J].Immunol Rev,2007,217：105-122.

[5]Crivellato E,Nico B,Ribatti D.Mast cells and tumour angiogenesis：new insight from experimental carcinogenesis[J].Cancer Lett, 2008,269(1)：1-6.

[6]Leskinen M,Wang Y,Leszczynski D,etal.Mast cellchymase induces apoptosis of vascular smooth muscle cells[J].Arteriosc ler Thromb Vasc Biol,2001,21(4)：516-522.

[7]Lundequist A,Tchougounova E,Abrink M,et al.Cooperation betweenmast cellcarboxypeptidase A and the chymasemousemast cell protease 4 in the formation and degradation ofangiotensinⅡ[J].J Biol Chem,2004,279(31)：32339-32344.

[8]Simard E,Jin D,Takai S,et al.Chymase-dependent conversion of big endothelin-1 in the mouse in vivo[J].JPharmacol Exp Ther, 2009,328(2)：540-548.

[9]Schneider LA,Schlenner SM,Feyerabend TB,et al.Molecular mechanism ofmast cell mediated innate defense against endothelin and snake venom sarafotoxin[J].J Exp Med,2007,204(11)：2629-2639.