葉 健,黨裔武,劉瓊東,魏 薇,徐春蘭,陳 罡,李云娟,羅殿中

(1廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育委員會,南寧 530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)病理教研室)

宮頸癌的發(fā)病率很高[1]。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)具有將正常細(xì)胞永生化的能力和高度種屬特異性以及特殊嗜上皮性,有 200多種基因型,其中40多種與生殖道疾病相關(guān)[2]。根據(jù)其致病能力強弱,HPV可以分為高危型和低危型,其中高危型HPV持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸癌已是不爭的事實。近年來發(fā)現(xiàn),采用基因芯片技術(shù)檢測HPV分型具有敏感性高、特異性強以及高通量等特點,但此技術(shù)多應(yīng)用于新鮮組織或新鮮脫落細(xì)胞檢測,應(yīng)用于石蠟包埋標(biāo)本的檢測報道少見。近期我們采用基因芯片技術(shù)對廣西地區(qū)的 163例宮頸癌石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行HPV亞型檢測,探討該技術(shù)應(yīng)用于HPV臨床診斷的可行性以及廣西地區(qū)宮頸癌患者HPV感染情況及其亞型分布規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 2006～2009年存檔的宮頸癌石蠟包埋組織標(biāo)本共163例,其中鱗癌131例(鱗癌組),腺癌 32例(腺癌組)。163例患者的年齡為 21～73(47.9± 4.3)歲,標(biāo)本取材前均未行放化療,均經(jīng)過HE復(fù)查篩選。所有患者均為廣西本地患者,祖輩 3代居住于廣西。

1.2 HPV檢測方法 采用基因芯片技術(shù)檢測石蠟包埋宮頸癌組織標(biāo)本中18種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和5種低危型HPV(HPV6、11、42、43、44)。HPV分型檢測試劑盒為深圳亞能生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。陽性對照為該公司提供的HPV52和HPV56合并感染的 2例組織切片,空白對照以蒸餾水替代DNA提取液。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。宮頸癌石蠟組織標(biāo)本4μm切片5片置EP管底,加入裂解液100μl,100℃水浴10min后立即 13 000 r/m離心10min,取中層DNA液5μl,加入含有通用引物的20μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：50℃15min、95℃10min、94℃30 s、42℃90 s、72℃30 s,40個循環(huán)后72℃延伸5 min。將固定了23種探針的膜條標(biāo)記后與PCR產(chǎn)物一起放入6 ml雜交液A[2×檸檬酸鈉緩沖液(SSC),0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]中,100℃變性10 min,后置于51℃雜交箱進(jìn)行雜交至少 1.5 h,雜交后將膜條置51℃預(yù)溫的洗滌液B(0.5×SSC+0.1%SDS)漂洗5min,用過氧化物酶溶液(1∶2 000)于室溫輕振搖30 min,A液搖洗2×5 min,0.1 M檸檬酸鈉液洗滌1～2 min,顯色 10～30 min后肉眼判讀結(jié)果。

每張膜條的內(nèi)對照(PC)位點出現(xiàn)藍(lán)色圓點即顯示該結(jié)果為有效結(jié)果。本研究的陽性對照為HPV52和HPV 56陽性,陰性對照未見顯色。受檢樣本的陽性在對應(yīng)的HPV亞型探針位點出現(xiàn)藍(lán)色圓點。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,率的比較采用 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片膜條結(jié)果 見圖1。

2.2 163例宮頸癌組織中HPV感染率 163例宮頸癌組織標(biāo)本中,HPV陽性155例,感染率為95.1%。其中鱗癌組為98.5%(129/131),腺癌組為81.3% (26/32),兩組比較,P=0.000(χ2=12.9)。

圖1 基因芯片膜條結(jié)果

2.3 宮頸癌組織中HPV高、低危亞型分布 所有HPV檢出病例中未見單一低危型HPV感染,共有3例為低、高危型復(fù)合感染,余均為高危型HPV單一感染或者是雙重感染。23種 HPV亞型中,共檢出16種亞型：HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73。其中 HPV 16為最常見的感染亞型,HPV 16陽性鱗癌組為103例(78.6%),腺癌組為7例(21.9%),兩組比較,P=0.000(χ2= 37.7);HPV18為宮頸癌中第2常見的感染亞型,鱗癌組HPV 18陽性15例(11.5%),腺癌組19例(59.4%),兩組比較,P=0.000(χ2=35.8);HPV 16和HPV18之后的感染亞型由高至低依次為鱗癌組：HPV59陽性7例(5.3%),HPV58、HPV33、HPV 31陽性各4例(3.1%),HPV 52、HPV68陽性各3例(2.3%);腺癌組：HPV52陽性2例(6.3%),HPV 35陽性1例(3.1%)。在檢出HPV陽性的155例中有128例為單一型感染(82.6%),27例為雙重感染(17.4%),未見三重及以上的多重感染,其中鱗癌組單一感染 106例(82.2%),雙重感染 23例(17.8%);腺癌組單一感染22例(84.6%),雙重感染4例(15.4%),兩組比較,P＞0.05。在檢出的16種HPV亞型中,除 HPV6、11、39、56、68、73為雙重感染外,其他亞型均存在單一感染和雙重感染。

3 討論

基因芯片技術(shù)集基因擴(kuò)增和核酸雜交技術(shù)于一體,針對HPV E1基因設(shè)計通用引物,對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后與固定在尼龍膜上的23種HPV亞型探針雜交,通過顯色直接肉眼判讀結(jié)果。該方法原理及操作簡單,僅需要普通的PCR儀和雜交箱等常用儀器設(shè)備即可。但它具有敏感性高,特異性強的特點,且能夠一次對常見的23種HPV亞型進(jìn)行分型,與 PCR需多個獨立反應(yīng)相比,基因芯片對HPV多重感染檢測尤顯其獨到的優(yōu)勢,節(jié)約了檢測的成本和檢測時間,降低了檢查費用,若將該技術(shù)與臨床病理形態(tài)學(xué)相結(jié)合,對宮頸癌的預(yù)測以及愈后的評估都具有重要的價值?；蛐酒壳按蠖鄳?yīng)用在宮頸脫落細(xì)胞HPV檢查,被譽為宮頸癌篩查的首選HPV分型檢測方法。本研究結(jié)果證實,基因芯片技術(shù)對宮頸癌石蠟包埋組織中HPV分型檢測具有優(yōu)勢,可以作為宮頸癌病理診斷的輔助手段。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),廣西地區(qū) 163例宮頸癌石蠟組織中HPV感染率為95.1%,其中鱗癌組感染率為98.5%,腺癌組為81.3%。所有感染病例均可見HPV高危亞型,除了 3例為高、低危亞型復(fù)合感染以外,余均為HPV高危亞型單一或雙重感染,未見單純的HPV低危亞型感染。因此,宮頸鱗癌的發(fā)生與高危型HPV感染更為密切。與Chen等[3]和Milde-Langosch等[4]的報道相一致。因此我們認(rèn)為廣西地區(qū)宮頸癌的發(fā)生與HPV感染關(guān)系密切。

有研究顯示[5],HPV 16是宮頸鱗癌和腺癌的一個重要致病因子,而HPV 18是與腺癌的關(guān)系更為密切。本研究發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18是廣西地區(qū)宮頸癌患者HPV感染的最常見亞型。其中宮頸鱗癌與HPV16感染更密切,感染率達(dá)78.6%,明顯高于腺癌的21.9%(P＜0.05);而HPV18與宮頸腺癌更密切,在腺癌中感染率達(dá)59.4%,而在鱗癌中HPV18陽性率為11.5%(P＜0.05)。因此,HPV16與宮頸鱗癌的發(fā)生、HPV 18與宮頸腺癌的發(fā)生關(guān)系密切。

僅次于HPV16和HPV18的感染亞型在鱗癌組依次為HPV59(5.3%)、HPV58(3.1%)、HPV33 (3.1%)、HPV 31(3.1%)、HPV 52(2.3%),腺癌組依次為HPV52(6.3%)、HPV35(3.1%),兩者相比未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。這與國內(nèi)外的一些報道有偏差。非洲、歐洲、南非、北美地區(qū)的研究報道[6],HPV16和HPV18同為宮頸癌中最常見的感染型,而位居第3、4位的是 HPV45、31、33;在亞洲,HPV 52、58比HPV45、31或 33更為常見[7,8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9],遼寧省1 444例宮頸疾病患者中,HPV16、18、58、33、31為最常見感染型。本研究結(jié)果中位居第 3位(鱗癌組)的HPV59與眾不同,可能正好反映了廣西地區(qū)宮頸癌患者HPV亞型分布特點,但是由于本研究樣本相對較少,不排除本結(jié)果所存在的偏差和局限性,不一定能夠代表廣西區(qū)域的整體情況,僅作為一項基礎(chǔ)研究,為日后大樣本的研究提供參考。

HPV單一感染或多重感染是否與宮頸癌發(fā)生相關(guān),報道結(jié)果不一致的。陶萍萍等[10]的研究顯示,HPV多重感染與宮頸病變呈正相關(guān)性,隨著宮頸病變級別增加,多重感染率呈增加趨勢,此提示機體免疫機制清除病毒不利,是病毒持續(xù)感染的危險因素,提示病情進(jìn)展,更易發(fā)展為宮頸癌。另有學(xué)者的研究結(jié)果卻顯示[11],隨著宮頸病變級別增加, HPV多重感染率趨于下降,且宮頸鱗癌HPV感染傾向于單一高危型。本研究結(jié)果顯示,全部HPV感染病例均為單一感染和雙重感染,且以單一感染為主,未見三重及以上的多重感染,鱗癌組和腺癌組的單一感染和雙重感染未見明顯規(guī)律。HPV各亞型的感染可能與機體免疫密切相關(guān),不同亞型在抵抗機體免疫清除可能存在有相互競爭作用,使其致病能力較強的HPV亞型持續(xù)感染,導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。

綜上所述,本研究證實基因芯片技術(shù)可對宮頸癌石蠟包埋組織切片進(jìn)行HPV分型檢測,具有簡便、高通量的特點,可預(yù)測宮頸疾病的發(fā)生與發(fā)展。

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