李又空,周家杰,張先覺,楊光華,丁 坤,王建國,朱 敏

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州市中心醫(yī)院,湖北荊州 434020)

Nodal蛋白是重要的細胞成形素,在胚胎發(fā)育及干細胞分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用[1]。其在發(fā)育的胚胎組織及細胞中一過性表達上升,隨著胚胎發(fā)育成熟及細胞分化其表達不斷降低,發(fā)育完全的組織細胞中幾乎不存在Nodal蛋白的表達。最新研究發(fā)現(xiàn),Nodal蛋白在人皮膚黑色素瘤組織細胞中存在較高的表達,并已證實其在黑色素瘤的生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著非常重要的作用[2,3]。而腫瘤干細胞理論認為腫瘤是一種干細胞疾病,在胚胎干細胞分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的細胞因子,同樣也在腫瘤的生長發(fā)育中起著非常重要的作用[4]?；诖死碚?我們以人膀胱移行細胞癌(下稱膀胱癌)組織標本為研究對象,觀察其組織中是否存在細胞成形素Nodal蛋白及mRNA的表達,并探討其表達與膀胱癌病理分級及臨床分期之間的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 17例膀胱癌組織為我院2009年 8月 ～2010年 8月手術切除標本,均經(jīng)病理證實。17例患者中,男10例,女7例;年齡35～75歲;臨床病理分級：Ⅰ級 5例、Ⅱ級 7例、Ⅲ級 5例。TNM分期：Ta期7例、T1期6例、T2～T4期4例。另取距腫瘤5 cm以外膀胱正常組織(病理檢查證實)6例為對照。標本切除后速置入液氮中,于 -80℃保存。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人Nodal單克隆抗體,辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗。電化學發(fā)光物(ECL)試劑盒。RNA提取試劑Trizol Reagent、Taq DNA聚合酶及禽骨髓母細胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶均購自Fermentas公司,引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 膀胱癌和膀胱正常組織中Nodal蛋白的檢測 采用Western blot法。提取各標本總蛋白并定量,8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜,37℃封閉1 h,一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育 2 h,洗膜后ECL顯影,暗室壓片曝光。所有實驗重復 3～5次。所得到的蛋白條帶經(jīng)掃描后計算各條帶與內(nèi)參 βactin吸光值(A值)的比值,此代表各標本中Nodal蛋白表達含量。

1.2.3 膀胱癌和膀胱正常組織中Nodal mRNA的檢測 采用RT-PCR法。參照Trizol Reagent說明書提取總RNA,RT反應條件：70℃5 min,37℃5 min,42℃60 min,70℃10 min;PCR反應條件：94℃5min,94℃30 s,55℃45 s,72℃1min,循環(huán)36次。以β-actin為PCR內(nèi)參。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)分析后,計算待測指標與β-actin A值的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較用單因素方差分析。α= 0.05。

2 結果

2.1 膀胱癌和膀胱正常組織中Nodal蛋白、mRNA表達變化 膀胱癌組織中有不同程度的Nodal蛋白、mRNA的表達,膀胱正常組織中均未檢測到Nodal蛋白、mRNA。詳見圖1。

2.2 Nodal蛋白、mRNA表達與膀胱癌分級、分期的關系 見表1。隨著病理分級的增高,Nodal蛋白、mRNA的表達均依次增強,Ⅲ級＞Ⅱ級(P＜0.05)＞Ⅰ級(P＜0.01);隨著膀胱癌臨床分期的升高, Nodal蛋白、mRNA表達漸次增強(P＜0.05)。

圖1 膀胱癌和膀胱正常組織中Noda l蛋白、mRNA表達情況

表1 Nodal表達與膀胱癌分級、分期的關系

3 討論

Nodal是誘導中胚層和內(nèi)胚層發(fā)育及干細胞分化調(diào)節(jié)的關鍵信號分子,并在機體左右非對稱發(fā)育中起著非常重要的作用[5]。Nodal突變小鼠不能形成原條和完整的中胚層,僅形成一些零星的后端中胚層[6]。由Nodal介導的上下游信號通路在維持人胚胎干細胞分化多潛能性中發(fā)揮著非常重要的作用,阻斷或干擾此信號通路能夠影響胚胎細胞的分化發(fā)育[5]。而目前研究認為,腫瘤分化的多潛能性與干細胞非常相似,因此有學者推測在胚胎發(fā)育及干細胞分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的細胞因子可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中同樣起著非常重要的作用[7,8]。

在胚胎干細胞中Nodal主要是通過與TGF-β1的Ⅰ型受體人間變性淋巴瘤激酶(ALKs)和Ⅱ型激活素樣激酶受體(ActRⅡB)結合激活下游的Smads蛋白從而發(fā)揮生理作用[5]。目前研究認為 TGF-β1/ ALK/Smads信號通路對膀胱癌的發(fā)展起著促進作用[9],因此我們推測,隨著正常組織向腫瘤組織的癌變,NodalmRNA被激活并開始表達Nodal蛋白,后者通過與ALKs及ActRⅡB所形成的異源二聚體受體復合物結合進行信號傳導,這種結合使ActRⅡB激活并磷酸化ALKs,并進一步由ALKs激活磷酸化下游的Smad2/3,從而促進腫瘤組織的浸潤生長及轉(zhuǎn)移。

基于此理論,本研究通過Western blot及RTPCR檢測膀胱癌組織中Nodal蛋白及mRNA發(fā)現(xiàn),其在膀胱癌組織中呈高表達,在膀胱正常組織中不表達,同時Nodal表達的強弱與膀胱癌病理分級及臨床分期存在一定的關系。隨著膀胱癌惡性程度的增高及浸潤性生長,Nodal的表達不斷升高,這與國外研究人員在黑色素瘤中所觀察到的結果一致[2,10]?？梢奛odal表達的強弱與腫瘤組織的惡性程度之間存在一定的相關性。臨床分期 Ta期及病理分級Ⅰ級的膀胱癌組織中即存在Nodal蛋白的表達,通過檢測膀胱癌組織中Nodal蛋白或mRNA可間接反映其惡性程度。

本研究結果提示,Nodal蛋白與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展存在著非常密切的聯(lián)系,其可成為膀胱癌早期檢測及治療的重要靶點。

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