張?zhí)煊?張琳剛,覃展偶,高 漓

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,其發(fā)病率在歐洲居第 5位,在美國居第 4位[1],在我國,男性膀胱癌發(fā)病率位居全身腫瘤的第 8位,女性排在第12位以后[2]。其中,膀胱尿路上皮癌占膀胱癌的90%以上[2,3]。其術(shù)后復(fù)發(fā)率高,為 50%～70%[4]。目前國內(nèi)較常使用的藥敏檢測法是四唑藍(lán)比色法(MTT法),但因其本身存在缺陷,使用受限。甲臜化合物(MTS)是MTT的一種新型類似物。2008年7月 ～2010年 4月,我們采用 MTS/吩嗪硫酸二甲酯(PMS)法檢測原代培養(yǎng)的膀胱尿路上皮癌(下稱膀胱癌)細(xì)胞對(duì)常用的 3種化療藥物的敏感性,為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集在我院手術(shù)(電切者術(shù)前活檢)治療的 29例膀胱癌患者的新鮮腫瘤組織標(biāo)本。29例患者中,男 23例,女性 6例;年齡 35～81歲,平均年齡60.5歲。膀胱癌分級(jí)：G1級(jí)11例,G2級(jí) 10例,G3級(jí)8例;臨床分期：Ta期 10例,T1期 19例。初發(fā) 20例,治療后復(fù)發(fā) 9例。術(shù)前均未進(jìn)行放化療。

1.2 藥物及主要試劑 羥基喜樹堿(HCPT)、吡柔比星(THP)、絲裂霉素C(MMC)。DMEM培養(yǎng)液,胎牛血清、MTS和PMS-20℃下避光保存,使用前將MTS標(biāo)記液和PMS偶聯(lián)劑解凍后以20∶1混合。1.3 原代細(xì)胞培養(yǎng) 將新鮮腫瘤組織標(biāo)本用120目及200目鉭網(wǎng)過濾,濾過液1 000 r/min、離心5 min,去上清,用PBS漂洗后加DMEM培養(yǎng)基,制成膀胱癌細(xì)胞懸液。

1.4 膀胱癌細(xì)胞藥敏性檢測 采用MTS/PMS法。將細(xì)胞懸液加入 96孔培養(yǎng)板中,150μl/孔,連續(xù)培養(yǎng)7 d,隔日換半液,設(shè)陰性對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔,每種藥物均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,加入HCPT、THP、MMC(藥物按臨床用藥量配制成試驗(yàn)用藥量,相應(yīng)劑量分別為 8、10、3 μg/ml)。培養(yǎng)20 h后,每孔加MTS/PMS混合液20 μl,經(jīng)37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。測490 nm波長處吸光度值(A值)。

1.5 藥敏評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 腫瘤細(xì)胞抑制率(IR)=(對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值 ×100%[6]。根據(jù) 1978年全國抗癌藥物會(huì)議制訂的抗腫瘤藥物通用指標(biāo)[7],IR＞70%為高度敏感, 50%～70%為中度敏感,30%～49%為低度敏感,＜30%為不敏感或耐藥。采用SPSS11.0軟件。兩兩比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本組 29例膀胱癌標(biāo)本中,獲得藥敏結(jié)果者 27例,可評(píng)價(jià)率為 93.1%(27/29)。失敗的2例均是由于組織中大量死亡細(xì)胞導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量不夠所致。3種藥物敏感性比較見表 1。

表1 27例膀胱癌原代細(xì)胞對(duì) 3種化療藥物敏感性比較

在有效的 27例膀胱癌原代細(xì)胞標(biāo)本中,對(duì) 3種藥物均高度敏感者12例(44.4%),對(duì)2種藥物高度敏感者15例(55.6%);對(duì)2種藥物中度敏感者3例(11.1%);對(duì)3種藥物均耐藥者 3例(3.7%),對(duì)2種藥物耐藥者2例(7.4%)。

3 討論

目前MTT為抗癌藥物篩選和臨床腫瘤藥敏試驗(yàn)的常用方法,但由于MTT經(jīng)活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化生成的藍(lán)紫色結(jié)晶物需加入二甲基亞砜溶解后方能比色,操作步驟繁瑣,且易影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而MTS優(yōu)點(diǎn)在于：①在PMS存在的條件下,可被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原形成極具水溶性的有色甲臜產(chǎn)物,省略了溶解過程,可減少人為的誤差及工作量。②MTS法顯色非?？?加入4 h后即可檢測。③其顏色深淺與細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)。④特異性強(qiáng)。MTS/PMS法形成甲臜產(chǎn)物為深棕色,影響因素較少。⑤安全,無需用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑去溶解甲臜產(chǎn)物(不象MTT)。

根據(jù)本研究結(jié)果我們認(rèn)為,采用MTS/PMS法檢測不同個(gè)體膀胱癌原代細(xì)胞藥敏性具有敏感、特異的特點(diǎn)。因?yàn)榘┘?xì)胞剛剛離體,生物學(xué)性狀尚未發(fā)生很大變化,能較真實(shí)地反映整個(gè)腫瘤細(xì)胞群體的特性及不同個(gè)體的差異,在一定程度上能代表體內(nèi)狀態(tài)[8,9]。

在本研究 29例膀胱癌標(biāo)本中,獲得藥敏結(jié)果者27例,可評(píng)價(jià)率為93.1%(27/29)。失敗的2例均是由于組織中大量死亡細(xì)胞導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)量不夠所致。其中HCPT抗癌活性最強(qiáng),明顯優(yōu)于THP和MMC;MMC耐藥性最強(qiáng)。有效的27例膀胱癌原代細(xì)胞標(biāo)本對(duì) 3種藥物均高度敏感者 12例(44.4%),對(duì)2種藥物高度敏感者15例(55.6%);對(duì)2種藥物中度敏感者3例(11.1%);對(duì)3種藥物均耐藥者 3例(3.7%),對(duì)2種藥物耐藥者2例(7.4%)。說明來源于不同個(gè)體的膀胱癌細(xì)胞在藥物敏感方面具有異質(zhì)性,提示進(jìn)行腫瘤個(gè)體化治療非常重要。

綜上所述,采用MTS/PMS法檢測膀胱癌原代細(xì)胞化療藥物敏感性具有敏感、特異等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于膀胱癌的體外藥敏檢測。而不同個(gè)體的膀胱腫瘤具有異質(zhì)性,因此應(yīng)根據(jù)MTS/PMS法所檢測的藥敏結(jié)果,制訂個(gè)體化膀胱癌化療方案。

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