肖躍海,孫 發(fā)＊,石家齊,谷 江,李崇斌,謝 春,夏曙華

(1貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴陽(yáng) 550004;2貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院)

已有研究證實(shí)[1,2],睪丸支持細(xì)胞分泌的干細(xì)胞因子(SCF)對(duì)生精細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡關(guān)系密切,同時(shí)又有研究表明,氟中毒可導(dǎo)致睪丸生精細(xì)胞凋亡增加,精子質(zhì)量下降[3～6]。但關(guān)于睪丸SCFmRNA在燃煤型氟中毒后睪丸組織中的表達(dá)目前尚無(wú)報(bào)道。2008年 1月 ～2010年 8月,我們通過(guò)構(gòu)建燃煤型氟中毒大鼠模型,觀(guān)察睪丸支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和睪丸組織中SCFmRNA的表達(dá),探討燃煤型氟中毒所致雄性大鼠生精障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及燃煤型氟中毒動(dòng)物模型制作 雄性SD大鼠20只,重 90～110 g,由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組、低氟組、中氟組、高氟組(后三組為染毒組),各5只。各組飼料成分相同(氟、玉米、豆粉、豆餅、麥麩、面粉、酵母粉、骨粉、芝麻餅、雞蛋、奶粉、鹽、菜油),含氟量及比例不同成分見(jiàn)表 1,余成分所占比例相同。自由飲用自來(lái)水。

表1 各組動(dòng)物飼料中氟含量及比例不同成分

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 主要試劑及器械 Trizol試劑、焦碳酸二乙酯、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒。透射電子顯微鏡、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng),高速冷凍離心機(jī)。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 喂飼90 d后,置大鼠于代謝籠,收集每只大鼠 24 h尿,用氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟水平;觀(guān)察氟斑牙出現(xiàn)情況,參考氟斑牙分度標(biāo)準(zhǔn)[4]給予分度。均采用股動(dòng)脈放血法處死大鼠,無(wú)菌取雙側(cè)睪丸。右側(cè)睪丸稱(chēng)重用以計(jì)算臟器系數(shù)(睪丸系數(shù)=睪丸質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量)。取左側(cè)睪丸取部分組織用以電鏡觀(guān)察,部分組織采用RT-PCR法檢測(cè)其中SCF mRNA表達(dá)變化。

1.2.2.1 睪丸支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 冰盒上剔除白膜取睪丸組織,2.5%戊二醛固定,10%乙二胺四乙酸(EDTA)蔗糖緩沖液,1%鋨酸后固定,梯度丙酮脫水,Epon 812浸透、包埋,6℃聚合12 h,制備超薄切片(50～70 nm),經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電子顯微鏡觀(guān)察。

1.2.2.2 RT-PCR法檢測(cè)大鼠睪丸組織中SCF mRNA表達(dá)情況 ①總RNA提?。簾o(wú)菌狀態(tài)下稱(chēng)取新鮮睪丸組織100 mg,提取總RNA,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。提取總 RNA后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度良好,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示3條帶,提示RNA完整。②cDNA合成：取各組總RNA 1μl,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。③PCR目的片段擴(kuò)增：從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)查找大鼠SCFmRNA系列,大鼠SCF引物系列、β-actin經(jīng)Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì),由上海金斯瑞公司合成。SCF mRNA上游引物為5′-CAAAACTGGTGGCGAATCTT-3′、下游引物為5′-GCCACGAGGTCATCCACTAT-3′,242 bp; β-actin上游引物為 5′-CAAAACTGGTGGCGAATCTT-3′、下游引物系列為5′-GCCACGAGGTCATCCACTAT-3′,242 bp。PCR反應(yīng)體系總體積50μl,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 35個(gè)循環(huán),72℃終延伸5m in。分別取PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,用紫外觀(guān)察儀進(jìn)行觀(guān)察拍照,用ImageJ軟件系統(tǒng)半定量分析。以同一體系中目的基因產(chǎn)物電泳條帶光密度值與內(nèi)參照β-actin條帶光密度值的比值來(lái)表示該樣品SCFmRNA的相對(duì)表達(dá)水平。(100 bp的DNA Marker購(gòu)自美國(guó)MBI公司)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。資料用±s表示,用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)分析。α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組尿氟水平和氟斑牙發(fā)生情況 對(duì)照組及低、中、高氟組尿氟分別為(1.7±0.1)、(3.0± 0.1)、(6.0±0.1)、(13.0±0.3)mg/L,發(fā)生氟斑牙分別為 0、2、5、5只;低、中、高氟組與對(duì)照組比較,P均 ＜0.01。氟斑牙 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度者,對(duì)照組分別為5、0、0、0只,低氟組分別為 3、2、0、0只,中氟組分別為 1、2、2、0只,高氟組分別為 0、1、3、1只,證明成功建立氟中毒模型。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量及睪丸系數(shù)比較見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體重、睪丸重量及睪丸系數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠體重、睪丸重量及睪丸系數(shù)比較(±s)

注：與對(duì)照組相比,＊P＜0.05,△P＜0.01

組別 體質(zhì)量(g)右側(cè)睪丸質(zhì)量(g)右側(cè)睪丸系數(shù)(%)對(duì)照組 377.8±6.18 1.814±0.02 0.480±0.01低氟組 375.4±5.55 1.734±0.03＊ 0.462±0.01＊中氟組 375.8±3.56 1.718±0.02△ 0.457±0.01△高氟組 376.0±4.85 1.620±0.06△ 0.430±0.01△

2.3 各組支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 電鏡下對(duì)照組呈正常支持細(xì)胞表現(xiàn);低、中、高氟組睪丸支持細(xì)胞胞質(zhì)中初級(jí)溶酶體增多,核高度畸形,染色質(zhì)邊集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生并高度擴(kuò)張,胞質(zhì)空泡化,且隨染氟劑量的增加核畸形加重。

2.4 SCFmRNA表達(dá) 低、中、高、氟組睪丸組織中SCFmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.71±0.05、0.68± 0.01、0.49±0.02,均明顯低于對(duì)照組的 0.73± 0.03(P分別 ＜0.05、0.01、0.01),且隨著氟中毒劑量的增加,低、中、高氟組睪丸組織中SCFmRNA依次降低(P均＜0.05)。

3 討論

大量研究表明[6,7],過(guò)量氟可破壞睪丸生殖細(xì)胞的形態(tài)和功能。氟可直接作用于睪丸組織,破壞睪丸各級(jí)生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及精子,導(dǎo)致精子畸形率增加、精子密度和精液質(zhì)量下降,燃煤型氟中毒是我國(guó)特有的氟中毒類(lèi)型,我們前期研究發(fā)現(xiàn),燃煤型氟中毒和其他類(lèi)型氟中毒相似,可導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡,影響精子質(zhì)量,但氟中毒所致生殖細(xì)胞凋亡機(jī)制至今尚不清楚。

SCF在睪丸組織中由睪丸支持細(xì)胞分泌,由于蛋白水解酶酶切位點(diǎn)不同,SCF分為sSCF和mSCF兩類(lèi),前者主要在造血系統(tǒng)中起作用,促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的增殖、分化、成熟;后者主要在睪丸組織中起作用,與生精關(guān)系密切[8]。在睪丸組織中,mSCF介導(dǎo)生精細(xì)胞黏附到支持細(xì)胞,誘導(dǎo)精原細(xì)胞由G1期向 S期過(guò)渡,促進(jìn)精原細(xì)胞增殖分化,減少精原細(xì)胞過(guò)度凋亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10],給予大鼠睪丸支持細(xì)胞損害劑2,5-己二酮后,總SCF mRNA的表達(dá)降低,其中模型mSCFmRNA降低明顯,sSCFmRNA無(wú)明顯變化,表明睪丸組織中SCF mRNA可以反映生精障礙。

本研究結(jié)果顯示,染氟 90 d后,對(duì)照組與各染氟組比較,大鼠的體重的變化不明顯,各染氟組大鼠睪丸質(zhì)量及睪丸系數(shù)較對(duì)照組有所下降,與文獻(xiàn)[11,12]的觀(guān)點(diǎn)相符。此外,與對(duì)照組比較,各染毒組睪丸支持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化：初級(jí)溶酶體增多,核高度畸形,染色質(zhì)邊集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生并高度擴(kuò)張,胞質(zhì)空泡化,胞質(zhì)電密度增高多突起,細(xì)胞間隙大。損傷程度隨染劑量的增加而加重。本研究結(jié)果還顯示,染氟 90 d后,低、中、高氟組睪丸組織中SCFmRNA較對(duì)照組下調(diào),并隨著氟中毒程度的加重而表達(dá)逐漸降低(P＜0.05),表明染氟程度與SCF表達(dá)有關(guān)。

精子的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。睪丸支持細(xì)胞是睪丸中唯一產(chǎn)生SCF的細(xì)胞,SCF與生精過(guò)程的啟動(dòng)有關(guān),與生精細(xì)胞分化、增殖、營(yíng)養(yǎng)、支持、保育及吞噬密切相關(guān),調(diào)控精子排放[1,2,8]。我們推測(cè),氟可能影響睪丸支持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),從而下調(diào)了SCFmRNA的表達(dá),導(dǎo)致生精功能變化。氟影響睪丸組織表達(dá)SCFmRNA的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]Reber L,Da Silva CA,Frossard N.Stem cell factor and its receptor c-kitas targets for inflammatory diseases[J].Eur J Pharmacol, 2006,533(1-3)：327-340.

[2]姜春霞,范清堂,程學(xué)敏,等.染氟大鼠生精細(xì)胞凋亡和血清雌二醇水平的關(guān)系[J].衛(wèi)生研究,2006,34(1)：32-35.

[3]Krasowska A,W lostowski T.Photoperiodic elevation of testicular zinc protects seminiferous tubules against fluoride toxicity in the bank vole(Clethrionomysglareolus),comp[J].Biochem Physiol, 1996,113(1)：81-84.

[4]謝春,張華,喻茂娟,等.燃煤型氟中毒大鼠血清骨保護(hù)素的變化[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2005,24(4)：378-381.

[5]Krasowska A,W?ostowski T,Bonda E,et al.Zinc protection from fluoride-induced testicular injury in the bank vole(Clethrionomys glareolus)[J].Toxicol Lett,2004,147(3)：229-235.

[6]李紅蕾,房慧伶.氟對(duì)小鼠生精細(xì)胞凋亡的影響及鋅的保護(hù)作用[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2008,27(B 06)：35-39.

[7]Dvorákorá-HortováK,Sandera M,JursovàM,etal.The influence of fluoridesonmouse sperm capacitation[J].Anim Reprod Sci,2008, 108(1-2)：157-170.

[8]Fox RA,Sigman M,Oekelheide K.Transmembraneversus soluble stem cell factor expressionin human testis[J].JAndrol,2000,21 (4)：579-585.

[9]Feng LX,Ravindranath N,Dym M.Stem cell factor/c-kit up-regulates cyclin D3 and promotes cell cycle progression via the phosphoinositide 3-kinase/p70 S6 kinase pathway in sper-matogonia [J].JBiol Chem,2000,275(33)：25572-25576.

[10]Allard EK,Blanchard KT,Boekelheide K.Exogenous stem cell factor compensates for altered endogenous SCF expression in 2,5-hexanedione induced testicular atrophy in rats[J].Biol Reprod,1996, 55(1)：185-193.

[11]Gupta RS,Khan TI,Agrawal D,et al.The toxic effects of sodium fluoride on the reproductive system ofmale rats[J].Toxicol Industrial Health,2007,23(9)：507-513.

[12]Ghosh D,Das S,Maiti R,etal.Testicular toxicity in sodium fluoride treated rats：association with oxidative stress[J].Reprod Toxicol, 2002,16(4)：385-390.