張 麗，趙 寧，王 蓉，李 林

（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053）

參烏膠囊是本室自行研制的復方中藥制劑，含制首烏、人參、石菖蒲等6味中藥，具有補腎益氣、豁痰化瘀功效。二苯乙烯苷是參烏膠囊中君藥何首烏的主要有效成分。本室以往的研究表明：參烏膠囊能夠明顯增加自然衰老大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、神經(jīng)生長因子及其受體的表達［1，2］；何首烏二苯乙烯苷可增加自然衰老大鼠海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元數(shù)量和突觸數(shù)量，保護突觸結(jié)構(gòu)，增高突觸生長素表達［3］，但對參烏膠囊和二苯乙烯苷在抗脊髓凋亡及神經(jīng)元存活信號轉(zhuǎn)導通路方面的作用尚未進行研究。本研究觀察了老年大鼠脊髓腰節(jié)段的凋亡調(diào)節(jié)因子Bax、Bcl-2及細胞存活信號轉(zhuǎn)導通路中磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）的表達，并應(yīng)用參烏膠囊及二苯乙烯苷對老年大鼠進行干預，以進一步闡明藥物促進脊髓神經(jīng)元存活、延緩脊髓神經(jīng)元衰老作用機制，為深入研究該藥抗衰老的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

參烏膠囊由制首烏、人參、石菖蒲等6味中藥組成，本研究室自行研制，本院中藥制劑室生產(chǎn)。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside，TSG）由本研究室自行研制，從何首烏中分離提取，純度為70％。

抗體均購自北京中山金橋生物技術(shù)公司。丙烯酰胺（Acr）、N，N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸胺（APS）、溴酚蘭（bromphenol blue）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑制肽（leupeptin），牛血清白蛋白（BSA），購自美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（NC膜），購自Gloucestemr公司。N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、二甲基甲酰胺、預染標準分子量蛋白質(zhì)（Western blotting marker），購自美國Gibco BRL公司。

1.2 儀器

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、濕轉(zhuǎn)電泳儀（美國Bio-Rad公司）；8453型紫外分光光度計（美國惠普公司）；低溫離心機（德國Beckman公司）。凝膠圖像分析掃描儀（英國Uvi公司）；凝膠成像分子系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）

1.3 實驗動物分組及給藥

Sprague Dawley（SD）大鼠，雄性，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，合格證號：SCXK（京2002-0001）。置于本院實驗動物室SPF環(huán)境即屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。按不同月齡分為6組：青年組對照組（6月齡），老年組（24月齡），老年+參烏膠囊（SW）小劑量組（0.8g/kg）、SW大劑量組（1.6g/kg）、二苯乙烯苷（TSG）小劑量組（0.03g/kg）、TSG大劑量組（0.06g/kg）。從21月齡開始灌胃給藥，每日1次，至24月齡，共3個月。青年對照和老年模型組給予等體積的蒸餾水。

1.4 大鼠脊髓腰節(jié)段BAX、Bcl-2、p-CREB蛋白含量測定

大鼠用10％水合氯醛腹腔麻醉，冰浴條件下取脊髓腰節(jié)段組織在電子天平上稱重，用0.05mol/L的Tris-Hcl（pH7.5）緩沖液制成10％的組織勻漿液，12 000r/min離心30min，取上清液，采用Folin酚法進行蛋白定量，用Western blotting方法測Bax、Bcl-2、p-CREB的蛋白含量。取上清液進行SDSPAGE電泳，冰浴中90V轉(zhuǎn)膜120min，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，用TBST（1％Tween，0.01mol/L Tris-Hcl緩沖液，pH7.5）輕輕漂洗硝酸纖維素膜，然后置于5％脫脂奶粉封閉液中，4℃過夜。棄去封閉液，TBST洗膜3次，每次5min。分別加入兔抗Bax抗體（1∶500稀釋），抗Bcl-2抗體（1∶1 600），抗p-CREB抗體（1∶400），置于搖床上搖動，室溫下2h。傾去一抗，TBST洗膜3次，每次15min。濾紙吸干硝酸纖維素膜的水分，分別加入用0.5％脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃反應(yīng)1h。棄去二抗，TBST洗膜3次，每次15min，熒光顯色并曝光，膠片采用計算機灰度掃描處理。用掃描儀將圖像轉(zhuǎn)入電腦中，使用凝膠成像分析系統(tǒng)，對各個條帶的整合灰度進行分析。將24月齡未用藥組（老年組）所對應(yīng)條帶的整合灰度值設(shè)定為100％，計算出其他各組對應(yīng)條帶的整合灰度值分別同老年組的相對百分比。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

組間樣本均數(shù)比較使用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），數(shù)據(jù)以±s表示。以P＜0.05計為差異有顯著性意義，以P＜0.01計為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段BAX表達的影響

Western blotting方法檢測顯示，與6月齡青年大鼠相比，24月齡老年大鼠脊髓腰節(jié)段細胞凋亡促進因子BAX的表達明顯增高（P＜0.01）。參烏膠囊小劑量（0.8g/kg）和大劑量（1.6g/kg）、二苯乙烯苷大劑量（0.06g/kg）灌胃給藥3個月，均可顯著降低老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bax的表達（P＜0.05，P＜0.01），二苯乙烯苷小劑量（0.03g/kg）有降低Bax表達的趨勢（表1，圖1）。

表1 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bax、Bcl-2、p-CREB表達的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of Shenwu capsule and tetrahydroxystilbene glucoside on Bax，Bcl-2，p-CREB in the lumbar spinal cord of aged rats

表1 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bax、Bcl-2、p-CREB表達的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of Shenwu capsule and tetrahydroxystilbene glucoside on Bax，Bcl-2，p-CREB in the lumbar spinal cord of aged rats

SW：參烏膠囊，TSG：二苯乙烯苷；±s；*P＜0.05，**P＜0.01與24月齡組比Note：SW：Shouwu capsule；TSG：tetrahydroxystilbene glucoside；±s；*P＜0.05，**P＜0.01，vs.24-months old group

組別Group Bax灰度值Integrated density Bcl-2灰度值Integrated density p-CREB灰度值Integrated density 6月齡6 mo 74.73±4.43** 178.3±14.9** 240.3±53.4** 24月齡24 mo 100.00±8.41 100.0±8.5 100.0±20.7 SW小劑量Low dose 75.47±9.64* 121.7±13.8 168.4±39.8* SW大劑量High dose 55.48±6.09** 129.9±27.7 134.1±28.5 TSG小劑量Low dose 88.94±10.87 146.4±20.4* 103.0±26.0 TSG大劑量High dose 63.70±20.97*148.6±35.3 96.8±4.4

圖1 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bax表達的影響Fig.1 Effects of Shenwu capsule and tetrahydroxystilbene glucoside on Bax in the lumbar spinal cord of aged rats

圖2 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bcl-2表達的影響Fig.2 Effects of Shenwu capsule and tetrahydroxystilbene glucoside on Bcl-2 in the lumbar spinal cord of aged rats

圖3 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段p-CREB表達影響Fig.3 Effects of Shenwu capsule and tetrahydroxystilbene glucoside on p-CREBin lumbar spinal cord of aged rats

2.2 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段細胞Bcl-2表達的影響

與6月齡青年大鼠相比，24月齡老年組大鼠脊髓腰節(jié)段細胞凋亡抑制因子Bcl-2的表達顯著下降（P＜0.01）。二苯乙烯苷小劑量可顯著增加老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bcl-2的表達（P＜0.05）；二苯乙烯苷大劑量，參烏膠囊小劑量和大劑量有增加Bcl-2表達的趨勢（表1，圖2）。

2.3 參烏膠囊和二苯乙烯苷對老年大鼠脊髓腰節(jié)段p-CREB表達的影響

與6月齡青年大鼠相比，24月齡老年大鼠脊髓腰節(jié)段p-CREB的表達顯著下降（P＜0.01）。參烏膠囊小劑量可顯著增加老年大鼠脊髓腰節(jié)段p-CREB的表達，參烏膠囊大劑量有增加p-CREB表達的趨勢；二苯乙烯苷對p-CREB的表達無明顯影響（表1，圖3）。

3 討論

在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中細胞凋亡扮演著重要的角色。神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育開始時往往產(chǎn)生過量的神經(jīng)元，而靶組織僅提供有限量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，許多神經(jīng)元由于缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子而發(fā)生凋亡。凋亡可能是引起神經(jīng)元丟失、影響運動神經(jīng)元再生和功能恢復的直接原因之一。干擾凋亡級聯(lián)反應(yīng)和促進神經(jīng)元生存而阻止因凋亡導致的死亡，是非常有效的方法。

神經(jīng)元內(nèi)Bcl和Bax的比例與神經(jīng)元的存活與否有關(guān)，比例高則神經(jīng)元趨于存活，反之則趨于凋亡。盡管細胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比例是固定的，但外界刺激可以改變抑制凋亡的Bcl-2-Bax、或促進凋亡的Bax-Bax的量發(fā)生改變。Bcl-2和Bax可通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡，隨著Bcl-2表達增多，Bax-Bax分開，形成Bcl-2-Bax異源二聚體，中和Bax-Bax的促進凋亡作用。脊髓的Bax免疫反應(yīng)陽性細胞集中于Ⅱ板層。而這些細胞所接受的前一站神經(jīng)元如脊神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)等也表達Bax蛋白［4］。本實驗觀察到促凋亡因子Bax在脊髓腰節(jié)段的表達隨著增齡而增加，老年期（24月齡）Bax的表達與青年期（6月齡）相比顯著增多，而抑制凋亡因子Bcl-2的表達隨著增齡而減少，推測可能是由于老年期神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)元存活通路中相關(guān)因子的表達降低兩方面因素，導致促細胞凋亡的因子Bax表達升高，抑制細胞凋亡的因子Bcl-2表達降低，細胞發(fā)生不同程度的凋亡；而參烏膠囊和二苯乙烯苷可以不同程度地抑制老年大鼠脊髓腰節(jié)段Bax的表達，增強Bcl-2的表達，從而發(fā)揮抗細胞凋亡，維持存活的作用。

脊髓神經(jīng)元的存活是維持脊髓功能的基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB或Akt）及其下游激酶P70核小體S6激酶（p70 ribosomal S6 kinase，p70S6K）信號轉(zhuǎn)導通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導通路，也是神經(jīng)細胞存活的重要信號轉(zhuǎn)導通路［5］。許多神經(jīng)營養(yǎng)因子與受體結(jié)合后通過激活對支持細胞存活發(fā)揮最重要作用的PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖和存活。神經(jīng)營養(yǎng)因子與相應(yīng)受體激活PI3K/Akt級聯(lián)反應(yīng)后Akt進一步激活下游的靶分子p70S6K，最終使cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化，啟動基因轉(zhuǎn)錄程序，發(fā)揮抑制細胞凋亡、保護細胞、促進神經(jīng)元存活的生物學作用［6］。

CREB調(diào)節(jié)著神經(jīng)元對各種NTFs包括NGF，BDNF等的反應(yīng)，它們對神經(jīng)元的存活、分化功能是必需的。磷酸化的CREB（p-CREB）通過激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進而表達一些蛋白分子如c-fos、Bcl-2，以及某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF、BDNF等，多種營養(yǎng)因子發(fā)揮協(xié)同作用從而刺激神經(jīng)細胞的存活和突起的生長［7］，這提示CREB可能調(diào)節(jié)著NTF誘導的調(diào)控神經(jīng)元存活的基因，激活CREB可促進細胞的存活。本研究結(jié)果顯示，老年大鼠脊髓腰節(jié)段PI3K/Akt神經(jīng)元存活信號轉(zhuǎn)導通路中的p-CREB明顯下調(diào)，老年期給予中藥參烏膠囊可以增強p-CREB表達，激活PI3K/Akt神經(jīng)元存活信號轉(zhuǎn)導通路，為闡明該藥促進脊髓神經(jīng)元存活、延緩神經(jīng)元衰老的作用機制提供了實驗依據(jù)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓調(diào)控凋亡相關(guān)因子和神經(jīng)元存活通路相關(guān)因子均存在著隨增齡的變化，而參烏膠囊及其有效成分二苯乙烯苷能夠抑制老年大鼠脊髓凋亡促進因Bax的表達和增高凋亡抑制因子Bcl-2的表達，上調(diào)神經(jīng)元存活通路中重要因子p-CREB的表達，在抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老方面顯示出一定的應(yīng)用前景，為進一步深入研究藥物的作用機制打下了基礎(chǔ)。

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