李鴻梅 李 昆 何海濤 劉劍凱 洪 敏

(吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室,吉林 長春 130021)

由于大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞膜上存在阿片受體,目前已被廣泛用作研究各種阿片類藥物作用機制的模型系統(tǒng)〔1,2〕。本實驗室研究發(fā)現(xiàn),海洛因不但能夠抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖,而且還能使細胞內(nèi)嘌呤核苷酸分解代謝增強〔3,4〕。已經(jīng)明確的是海洛因?qū)?C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖有抑制作用,但是嘌呤核苷酸對經(jīng)過海洛因處理過的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖是否有影響并未見報道。本實驗在前期研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上,以大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞作為靶細胞,研究嘌呤核苷酸對海洛因處理的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響,探索嘌呤核苷酸治療阿片類成癮的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 C6細胞株購自上海細胞研究所。低溫臺式離心機購自上?；C械廠。倒置顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自日本 SANYO公司。超凈工作臺購自蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自

Gibco公司,新生牛血清購自天津血液研究所。噻唑藍(MTT)、一磷酸腺苷 AMP和一磷酸鳥苷 GMP購自 Sigma公司。海洛因 (純度為 99%)由吉林省公安廳提供,臨用時用滅菌三蒸水溶解。

1.2 大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng) C6為貼壁生長的細胞。培養(yǎng)基為 DMEM,每 100 ml培養(yǎng)基含青霉素 1萬 U,鏈霉素10 mg,新生牛血清 15 ml,用滅菌的 5.6%NaHCO3溶液調(diào)p H7.2,置于 CO2孵箱,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞生長至近融合狀態(tài)時,用 0.25%胰酶消化傳代,每周 2～3次。

1.3 MTT比色法檢測海洛因?qū)?C6細胞增殖的影響及最佳藥物劑量篩選 將處于對數(shù)生長期的細胞,用 0.25%胰酶消化,用吸管將細胞吹打成單細胞懸液,血細胞計數(shù)板計數(shù);將細胞以 1×104個/cm2的濃度接種到 96孔細胞培養(yǎng)板中,每組均設(shè) 3個平行孔。以生理鹽水作對照,加入海洛因使其終濃度分別為 10、40、80和 120 mg/L,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后加入 20μl濃度為 5 g/L的 MTT,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;棄培養(yǎng)基,每孔加入 DMSO 200μl,室溫振蕩 10 min后,用酶標儀在波長 490nm處測定吸光度值,計算細胞的生存率 (%)=(各實驗組 OD值/對照組 OD值)×100%,繪制細胞生長曲線。

1.4 MTT比色法測定嘌呤核苷酸對海洛因處理細胞增殖的影響 將處于對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化,用吸管將細胞吹打成單細胞懸液,血球計數(shù)板計數(shù);將細胞以 1×104個/cm2的濃度接種到 96孔細胞培養(yǎng)板中,每組均設(shè) 3個平行孔。對照組為海洛因處理組,加入海洛因使其終濃度為120mg/L;嘌呤核苷酸處理組在加入 120 mg/L海洛因的同時,加入等摩爾混合的嘌呤核苷酸,使嘌呤核苷酸終濃度分別為10、40、80和 120 mg/L,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后加入 20μl濃度為 5g/L的 MTT,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;每孔加入 DMSO 200μl,室溫振蕩 10min后,用酶標儀在波長 490nm處測定吸光度值,計算細胞生存率(%)=(各實驗組 OD值/對照組 OD值)×100%,繪制細胞生長曲線。

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差齊性檢驗及成組設(shè)計資料 t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 海洛因?qū)6細胞增殖的影響及最佳藥物濃度 MTT實驗發(fā)現(xiàn),低劑量 (10 mg/L)的海洛因?qū)Υ笫?C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用并不明顯,490 nm處吸光度值為 1.393±0.084,其抑制率僅為 7%,與對照組(1.497±0.091)比較差異不顯著 (P＞0.05)。當海洛因的濃度達到 40 mg/L時,490nm處吸光度值為 0.967±0.097,對 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制率為 35%;海洛因濃度為 80mg/L時,490 nm處吸光度值為0.777±0.067,抑制率為 48%;海洛因濃度為 120 mg/L時,490nm處吸光度值為 0.713±0.068,抑制率為 52%;與對照組比較,差異均有顯著性 (P＜0.05)。因此本文選擇 120mg/L的海洛因作為最佳藥物劑量。

2.2 嘌呤核苷酸對海洛因處理的 C6細胞增殖的影響 海洛因?qū)φ战M 490 nm處OD值為 0.847±0.081,與海洛因組比較,嘌呤核苷酸的濃度為 10和 40 mg/L時,490 nm處OD值分別為(0.573±0.077,0.803±0.098),對大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用并不明顯 (P＞0.05)。嘌呤核苷酸的濃度達到80 mg/L時,490 nm處 OD值為 1.037±0.059,細胞增殖率為22%;嘌呤核苷酸的濃度為 120 mg/L時,490 nm處 OD值為1.097±0.114,細胞增殖率為 30%;與海洛因組比較,差異均有顯著性 (P＜0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),海洛因能夠抑制體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元細胞增殖,其機制是海洛因誘導神經(jīng)元細胞凋亡〔5〕。阿片類藥物嗎啡對去甲基丙咪嗪 (抗抑郁藥)和內(nèi)皮素等藥物處理后的大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖有抑制作用〔6〕。除此之外,本研究還發(fā)現(xiàn),嗎啡對沒有經(jīng)過任何藥物處理的大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖也有抑制作用〔7〕。海洛因抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖,其機制是海洛因使大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中增殖細胞核抗原(PCNA)表達減少〔3,4〕。本實驗通過 MTT比色法也證實了海洛因濃度達到 40mg/L時,以劑量依賴的方式抑制大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖。同時,本實驗通過 MTT比色法證明,嘌呤核苷酸的濃度達到 80 mg/L時,以劑量依賴的方式促進大鼠 C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖。這一結(jié)果表明,嘌呤核苷酸能夠?qū)购Ｂ逡驅(qū)Υ笫驝6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用,其機制有待進一步探討。

1 Bohn LM,Belcheva MM,Coscia CJ.Evidence for kappa-and mu-opioid receptor expression in C6 glioma cells〔J〕.J Neurochem,1998;70(5):1819-25.

2 Hauser KF,Houdi AA,Trubek CS,et al.Opioid intrinsically inhibit the genesis of mousecerebellar granule neuron precursors in vitro:differential impact of mu and delta receptor activation on proliferation and neurite elongation〔J〕.Eur JNerosci,2000;12(4):1281-93.

3 遲秀梅,張紀周,闞慕杰,等.海洛因?qū)?C6細胞增殖細胞核抗原基因表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版),2008;34(6):949-51.

4 遲秀梅,闞慕杰,李 奇,等.海洛因?qū)?C6細胞嘌呤核苷酸分解代謝基因表達的影響〔J〕.中國實驗診斷學,2008;12(5):589-91.

5 劉小山,臧林泉,蒿自睿,等 .海洛因誘導大腦神經(jīng)元凋亡的研究〔J〕.法醫(yī)學雜志,2007;23(1):14-7.

6 Bohn LM,Belcheva MM,Coscia CJ.Mu-opioid agonist inhibition of kappa-opioid receptor-stimulated extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is dynamic-dependent in C6 glioma cells〔J〕.J Neurochem,2000;74(2):574-81.

7 姚路禹,洪新雨,洪 敏,等.嗎啡對培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)細胞瘤 C6細胞增殖的抑制作用〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版),2002;28(6):594-6.