彭苗苗，方 蕓（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院，南京市 210008；2.南京市鼓樓醫(yī)院，南京市210008）

中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的重中之重，其本質(zhì)是尋找一種可以發(fā)揮綜合藥理作用的特殊的化學(xué)藥物整體。如今，各種新興技術(shù)的發(fā)展為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了有力工具，如膜分離、血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)、藥動學(xué)、生物膜色譜、Caco-2細(xì)胞、指紋圖譜、計(jì)算機(jī)學(xué)和高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展以及天然組合化學(xué)庫和中藥多靶點(diǎn)作用機(jī)制、系統(tǒng)生物學(xué)、化學(xué)物質(zhì)組學(xué)等理論體系的發(fā)展，使藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究取得了長足進(jìn)步。本文著重就有關(guān)研究方法技術(shù)及理論體系進(jìn)展作一綜述。

1 研究技術(shù)和方法

1.1 體內(nèi)化學(xué)成分研究方法

體內(nèi)化學(xué)成分研究的方法有血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)及藥動學(xué)。血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)的緊密結(jié)合，有助于中藥藥動學(xué)的研究和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明。而中藥藥動學(xué)的研究又對血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)提出了更高的要求。

血清藥理學(xué)最早是由日本學(xué)者田代真一在20世紀(jì)80年代提出并應(yīng)用于中藥方劑有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的，其理論依據(jù)是中藥成分雖然復(fù)雜，但進(jìn)入體內(nèi)且被測到的化學(xué)成分?jǐn)?shù)目是有限的。體內(nèi)復(fù)方來源的化學(xué)成分，可以代表方劑整體藥效，其體內(nèi)藥動過程和藥效存在相關(guān)性，因此可以用含有有效成分的血清進(jìn)行藥效學(xué)研究，分析復(fù)方成分變化引起的效應(yīng)改變。曹宜等[1]用血清藥理學(xué)的方法研究茵陳蒿湯提取物的保肝作用，提示茵陳蒿湯的保肝物質(zhì)是醇溶性的，且是其中極性比較小的部分。但血清藥理學(xué)缺點(diǎn)在于血清中成分不清楚，還是一種“黑箱”操作，因此還需借助血清藥物化學(xué)進(jìn)行研究。

中藥血清藥物化學(xué)是在全面分析中藥入血成分的基礎(chǔ)上，通過藥效相關(guān)性實(shí)驗(yàn)確定真正的有效成分，并對有效成分的體內(nèi)動態(tài)、代謝及消長規(guī)律進(jìn)行研究，從而闡明整個復(fù)方的藥動學(xué)特征。竇志華等[2]對復(fù)方五仁醇膠囊進(jìn)行了血清藥物化學(xué)研究，用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法，比較復(fù)方五仁醇膠囊含藥血清色譜圖和空白血清色譜圖，分析該制劑給藥后血清中產(chǎn)生的藥源性成分。靜脈給藥后血清中產(chǎn)生的13個藥源性成分全部來自君藥五味子，這些成分可能是復(fù)方五仁醇膠囊體內(nèi)直接作用物質(zhì)。王喜軍等[3]對六味地黃丸進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，口服后發(fā)現(xiàn)了11個入血成分，其中4個為新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，7個為六味地黃丸體外所含成分的原型。

中藥血清藥物化學(xué)推動了中藥藥動學(xué)的發(fā)展。中藥藥動學(xué)主要研究中藥有效成分、單方及復(fù)方體內(nèi)過程動態(tài)變化的規(guī)律，并將研究結(jié)果用數(shù)學(xué)方程和相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)來表達(dá)。如，曾俊芬等[4]對生化湯的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究，用HPLC法測定阿魏酸的含量，得知兔口服生化湯后體內(nèi)阿魏酸的分布代謝呈二室模型，其達(dá)峰時間為11.69分鐘。

1.2 生物膜色譜法

中藥提取物不經(jīng)分離直接與模擬生物膜結(jié)合，能夠很好地闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。由于模擬生物膜可以通過改變相關(guān)的影響因子很方便地模擬人體的生理環(huán)境，而且有較好的穩(wěn)定性，因此為研究藥物在體內(nèi)的吸收以及活性成分的篩選提供了一種簡便的模型。

1995年，Beigi F等[5]首次采用凝膠作為載體、利用固定化的脂質(zhì)體作為固定相，模擬小腸上皮細(xì)胞對藥物的吸收過程。隨后，國內(nèi)的毛希琴等[6]對這一方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立以涂敷磷脂的硅膠作為模擬生物膜的固定相，用于預(yù)測藥物的小腸吸收，并且將該技術(shù)成功應(yīng)用于單味中藥的研究。齊煉文等[7]將脂質(zhì)體作為模擬生物膜，采用平衡透析與液相色譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種研究中藥成分與模擬生物膜之間相互作用的新方法。該方法可用于預(yù)測藥物在體內(nèi)的吸收情況，進(jìn)而研究中草藥及復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。毛希琴等[8]采用涂敷磷脂的硅膠為模擬生物膜色譜固定相，與傳統(tǒng)的凝膠載體相比固定相的機(jī)械強(qiáng)度及磷脂固載能力均有較大提高，且有較好的穩(wěn)定性，用3種緩沖條件模擬小腸吸收的緩沖環(huán)境，同時涂敷磷脂形成的脂環(huán)境能夠較好的模擬細(xì)胞膜所起的作用，使得用色譜模型預(yù)測藥物小腸吸收的準(zhǔn)確程度有了很大提高。

1.3 Caco-2細(xì)胞技術(shù)

Caco-2細(xì)胞模型是一種在體外研究藥物分子穿越特定生物屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的新工具。由于具有體內(nèi)腸上皮的許多形態(tài)和功能上的性質(zhì)，它為研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、預(yù)測藥物的小腸吸收情況以及藥物在腸道的代謝提供了基礎(chǔ)。Caco-2細(xì)胞模型被認(rèn)為是目前最好的體外吸收模型，可用于快速評估新藥的細(xì)胞滲透性，闡明藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑，評價提高膜通透性的方法，確定被動擴(kuò)散的藥物最合適的理化性質(zhì)和評估新藥的潛在毒性作用等，成為藥物吸收研究的必備手段。

經(jīng)典的Caco-2細(xì)胞模型是在Transwell板上培養(yǎng)單層Caco-2細(xì)胞，多用于單體藥物吸收的研究。董倩倩等[9]將Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行改良，加大細(xì)胞量，直接進(jìn)行丹參成分的吸收研究，并結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，將可吸收成分的篩選和鑒定結(jié)合起來，為復(fù)雜的中藥體系活性物質(zhì)體外篩選提供了一個途徑。Boyer J等[10]利用單層Caco-2細(xì)胞研究蘋果和大蔥勻漿中槲皮素苷和苷元的吸收。結(jié)果表明，經(jīng)乳糖酶處理的蘋果和大蔥勻漿可以增加槲皮素的生物利用度?？梢?，Caco-2細(xì)胞模型為檢測黃酮葡萄糖苷從食物吸收的生物利用度提供了可靠的體外模型。

1.4 指紋圖譜技術(shù)

中藥材或中成藥經(jīng)過適當(dāng)處理后，利用現(xiàn)代信息采集技術(shù)和質(zhì)量分析手段得到的能夠顯現(xiàn)中藥材或中成藥性質(zhì)的圖像、圖形、光譜的圖譜及其數(shù)據(jù)，稱為中藥指紋圖譜[11]。對于中藥的多成分和整體作用，應(yīng)該用指紋圖譜的方法來控制中藥直接提取物中的盡量多的成分。它可以較全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量和中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供科學(xué)性和合理性?，F(xiàn)階段中藥的有效成分大多尚未明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好符合中藥質(zhì)控整體性的要求，較之單一成分或指標(biāo)成分的質(zhì)控方法，更具有科學(xué)性和全面性。

目前，指紋圖譜的測定多采用HPLC法。梁生旺等[12]采用HPLC法分析，獲得金銀花不同提取部位的指紋圖譜，同時選擇小鼠耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)測定不同提取部位的藥理活性，以線性回歸解釋化學(xué)信息和藥理活性的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果，以甲醇提取部位的藥理活性最強(qiáng)，故以此部位的HPLC圖譜來制定金銀花的“藥譜”。李康等[13]在減味藿香正氣水藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究中得出色譜峰X3和X25所代表的化學(xué)成分量的增加能增強(qiáng)對乙酰膽堿刺激的家兔離體兔腸的抑制作用強(qiáng)度，確定X3和X25代表的化學(xué)成分為該藥對家兔離體兔腸抑制的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但是在中藥指紋圖譜中，可能還含有很多未知化合物，該對它們?nèi)绾翁幚磉€是一個尚待解決的問題。

1.5 高通量篩選技術(shù)

高通量篩選應(yīng)用多種藥物作用靶點(diǎn)對大量化合物進(jìn)行高速、高效、低成本、微量化的篩選，最大限度地發(fā)現(xiàn)藥物。它將化學(xué)、基因組研究、分子生物學(xué)以及自動化儀器等先進(jìn)技術(shù)有機(jī)組合成一個高程序、高自動化的新模式，從而創(chuàng)造了發(fā)現(xiàn)新藥的新程序。

藥物必須通過多種生物膜才能到達(dá)靶區(qū)，藥物的細(xì)胞內(nèi)活性要求其必須通透目標(biāo)細(xì)胞的生物膜才能起作用。當(dāng)前，從考察藥物膜通透性來進(jìn)行活性分析，是篩選組合化學(xué)庫和中藥天然成分庫的一個新亮點(diǎn)。朱深銀等[14]建立了黃嘌呤氧化酶活性的紫外檢測法及其抑制劑體外高通量篩選模型，通過對篩選條件優(yōu)化，建立了可靠的篩選模型，并對71 760種樣品進(jìn)行了初篩，發(fā)現(xiàn)27個活性化合物，命中率為0.038%，其中有17個有較好量-效關(guān)系。張丹參等[15]通過對建立的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）抑制劑的高通量篩選模型，對不同來源的31 098個化合物樣品進(jìn)行高通量篩選。通過初篩和復(fù)篩，從中發(fā)現(xiàn)了4個有較強(qiáng)抑制活性的樣品。該模型適合于大規(guī)模的高通量篩選，平均日篩選量可達(dá)15 000樣次以上，為尋找新的GST抑制劑提供了一種先進(jìn)的技術(shù)手段。

2 中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究的理論體系

2.1 天然組合化學(xué)庫和多靶點(diǎn)作用機(jī)制

周俊院士提出的天然組合化學(xué)庫的思想和中藥多靶點(diǎn)作用的機(jī)制，為我們研究復(fù)方提供了理論依據(jù)。他認(rèn)為中藥復(fù)方是一個天然組合化學(xué)庫，是根據(jù)中醫(yī)理論和實(shí)踐以及單味藥的功能主治性味，通過人工組合形成的具有療效且相對安全的天然組合化學(xué)庫。這種“天然組合化學(xué)庫”具有兩個基本特點(diǎn)：①含有幾種或某群有效或有生物活性的化學(xué)成分；②所含的化學(xué)成分是多類型的，可能含有酚類、生物堿、萜類、甾體和配糖體等，是一個多樣化的庫。我們要做的是找到某種分離手段從中藥及其復(fù)方中獲取“天然組合化學(xué)庫”。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的生物活性篩選/化學(xué)在線分析方法[16]，能夠使有效成分的分離與篩選相結(jié)合，克服以往先從中藥中分離單體或有效部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應(yīng)篩選脫節(jié)的弊端，有助于闡明中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

無機(jī)陶瓷膜分離技術(shù)進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究時，依據(jù)中藥有效成分的分子量特征，對中藥及其復(fù)方進(jìn)行“集群篩選”，既符合中醫(yī)藥理論的核心“整體觀念”，又與當(dāng)今藥學(xué)學(xué)科前沿“天然組合化學(xué)庫”研究思路不謀而合[17]。鑒于開展這種“天然組合化學(xué)庫”所發(fā)揮的“多靶作用”研究的復(fù)雜性，由藥理模型來篩選“天然組合化學(xué)庫”必將是十分艱巨而遙遠(yuǎn)的歷程。

2.2 系統(tǒng)生物學(xué)和整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)

2.2.1 系統(tǒng)生物學(xué)：系統(tǒng)生物學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)提出之后，首次在分子生物學(xué)的知識框架下，從整體層次上研究生命系統(tǒng)的一門新興科學(xué)[18]。系統(tǒng)生物學(xué)認(rèn)為生物系統(tǒng)具有“整體、動態(tài)、層次、整合”的特點(diǎn)，通過生物體內(nèi)不同網(wǎng)絡(luò)之間的信息傳遞和整合，使基因或蛋白質(zhì)產(chǎn)生出最終的生物學(xué)功能。它在以往分子生物學(xué)提供的大量基因、蛋白質(zhì)等系統(tǒng)構(gòu)成信息的基礎(chǔ)上將單個生物分子放在整體中加以研究，并以了解整體層次的功能為最終目的。

中醫(yī)藥理論的特色之一就是整體性，而且中藥在與人體作用時其活性成分與靶系統(tǒng)之間發(fā)揮著強(qiáng)大的系統(tǒng)與系統(tǒng)的作用，這種整體性思想和用藥規(guī)律與系統(tǒng)生物學(xué)具有相通性，會促使中醫(yī)藥學(xué)在其自身發(fā)展中借助系統(tǒng)生物學(xué)這門現(xiàn)代生物學(xué)的語言、手段和成果去闡述和進(jìn)行理論創(chuàng)新[19]。

2.2.2 整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)：羅國安等[20]以中醫(yī)藥學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，建立一個整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)體系，用于研究外部干預(yù)系統(tǒng)（中藥復(fù)方）與生物應(yīng)答系統(tǒng)（人體復(fù)雜系統(tǒng)）之間“系統(tǒng)-系統(tǒng)”的相互作用。整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)提供了一個中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)交流融合的平臺，有助于全面、系統(tǒng)、深刻的揭示中醫(yī)方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，闡明中藥復(fù)方的配伍規(guī)律，指導(dǎo)復(fù)方新藥研發(fā)，更好地傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論。

3 結(jié)語

中藥復(fù)方十分復(fù)雜，使其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究比較困難，表現(xiàn)在：（1）中藥復(fù)方的有效成分是一個復(fù)雜的多成分組合，即多種成分共同發(fā)揮作用；（2）中藥復(fù)方有效成分可能是中藥原藥材中不存在的物質(zhì)，在復(fù)方煎制過程中通過多種成分相互作用產(chǎn)生，也可能是藥物進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)過體內(nèi)代謝產(chǎn)生的；（3）有些有效成分可能是間接途徑發(fā)揮作用，在脫離機(jī)體整體后單獨(dú)成分可能不能表現(xiàn)出應(yīng)有的作用；（4）有些成分的作用可能是我們目前尚未認(rèn)識的，對這些成分，在研究中可能被忽視。因此，中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究要從傳統(tǒng)的思路和方法中走出，不斷引入新的理論、思路、方法和技術(shù)?，F(xiàn)在很多相關(guān)學(xué)科的研究成果被應(yīng)用到此領(lǐng)域中來，將中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)與基因、蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)起來進(jìn)行高通量篩選。血清藥理學(xué)與血清藥物化學(xué)、藥動學(xué)、生物膜色譜、指紋圖譜、生物芯片、高通量篩選等技術(shù)整合到中藥復(fù)方的研究中，具有廣闊的發(fā)展前景。這些方法和技術(shù)的綜合運(yùn)用，可能會在中藥復(fù)方效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面取得重大突破，從而對闡明與發(fā)展中醫(yī)藥理論，闡釋復(fù)方制劑化學(xué)成分變化規(guī)律產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響；并為創(chuàng)制現(xiàn)代新型中藥、提高中藥質(zhì)控水平、實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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