徐若男 施 明 王福生 (解放軍第三○二醫(yī)院生物治療研究中心,北京100039)

1966年間充質(zhì)干細(xì)胞首先由Friedenstein[1]從骨髓中發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)理論認(rèn)為這群細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可向中胚層細(xì)胞即骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞具有向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層包括肌健、韌帶、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨髓基質(zhì)等分化發(fā)育的潛能[2]。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞易于培養(yǎng)、可大量擴(kuò)增、遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定且多向分化特性不會(huì)受到影響[3],臨床上常被用于細(xì)胞(或組織)替代治療。但成人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降,且供者間充質(zhì)干細(xì)胞的采集須行骨髓穿刺術(shù),由于疾病的原因,病人常有感染、體質(zhì)較弱等因素也限制了自體骨髓MSC移植的應(yīng)用。因此尋找新的MSC來源是目前國內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。臍帶來源廣泛,便于取材,對(duì)供者無不利影響,無倫理道德問題的限制,且細(xì)胞增殖、分化能力較強(qiáng),適合體外大規(guī)模培養(yǎng)。因此,臍帶MSC(Umbilical Cord-MSC)有望成為骨髓MSC的理想替代來源。正確分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、鑒定其表型和功能、研究在疾病治療中的具體作用機(jī)制以及與其它免疫細(xì)胞之間的相互關(guān)系,對(duì)于深入認(rèn)識(shí)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性、加速臨床應(yīng)用進(jìn)展具有非常重要的意義。ton's膠質(zhì)和血管周圍組織中分離培養(yǎng)出了MSC,并建立了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。常用的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離方法主要包括植塊法和酶解法。依據(jù)選取消化酶的種類又可分為膠原酶消化、胰酶消化和兩種酶順序消化法。其中植塊法對(duì)細(xì)胞直接損傷小,原代培養(yǎng)細(xì)胞純度高,簡單、經(jīng)濟(jì),但所需培養(yǎng)時(shí)間長。酶解法獲得細(xì)胞數(shù)量大,培養(yǎng)時(shí)間短,但細(xì)胞純度略低,同時(shí)異源蛋白的引入會(huì)增加臨床應(yīng)用過程中發(fā)生過敏反應(yīng)的可能性。

就取材方便及對(duì)供者的影響而言,臍血和臍帶是較理想的MSC來源。關(guān)于臍血MSC的報(bào)道存在較多爭議,主要是其多系分化潛能較弱,會(huì)出現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志SH-2、SH-3和SH-4表達(dá)缺失的現(xiàn)象。臍血分離的要求也較為嚴(yán)格,例如分離取材時(shí)間不得大于15個(gè)小時(shí),體積不得少于33ml等,而細(xì)胞分離效果只為1/100萬,且分離成功率也僅為60%。同時(shí)臍血MSC的分離會(huì)損失臍血中造血干細(xì)胞。而臍帶來源廣泛,不影響胎兒臍帶血的保存,無道德倫理問題的限制,易于體外大量擴(kuò)增,培養(yǎng)成功率高達(dá)100%。并且臍帶可望作為自體MSC來源和臍血共同移植,以提高臍血移植成功率。因此,臍帶MSC有望成為骨髓MSC的理想替代來源。

1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的采集和優(yōu)勢

目前間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源為成人骨髓,但成人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而逐漸減弱,且病毒感染率較高、來源受到限制。因此尋找新的MSC來源顯得尤為重要。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入,已可從臍帶、臍帶血、骨骼肌細(xì)胞、脂肪、滑膜和肝臟等多種組織中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞。2000年,Rrices[4]首次報(bào)道了臍帶血中可以分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞,隨后Romanov等又分別從臍靜脈內(nèi)皮和內(nèi)皮下、臍帶Whar-

2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及功能研究

研究顯示MSC具有異質(zhì)性,其表達(dá)的表面標(biāo)志抗原較為復(fù)雜。如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志,主要包括:①粘附分子 ,如 CD166、CD54、CD102、CD44、CD106 等;②生長因子和細(xì)胞因子受體,如白介素1受體(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、干擾素受體 、腫瘤壞死因子α等;③整合素家族成員,包括 CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104 等;④ 其它如 CD90、CD105等。許多研究表明不同組織來源的MSC同時(shí)又具有相似的免疫表型特征[5],表現(xiàn)為SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4 、CD166 、CD13 、CD29 、CD44等粘附分子陽性,不表達(dá)造血和內(nèi)皮標(biāo)記,如CD34、CD31和 CD45等。表達(dá)HLA-I,不表達(dá)HLA-DR,不表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80、CD86和CD40。

胎兒組織來源的MSC分化程度更低,還可以表達(dá)其它動(dòng)物如馬源的SSEA-1、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和豬源的 Nanog,Oct-4、Sox-2、Rex-1 等分子 ,其比成人組織來源MSC具有更高的增殖能力和較弱的免疫調(diào)控能力。但與胚胎干細(xì)胞比較體外傳代后基因遺傳穩(wěn)定性更強(qiáng)。骨髓MSC在體外培養(yǎng)8～15代或倍增25～40代后,增長停滯,開始分化過程,出現(xiàn)細(xì)胞變大、緊密連接消失、增殖速度減慢等現(xiàn)象,同時(shí)細(xì)胞表型和功能分析顯示細(xì)胞出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。臍帶MSC擁有很多骨髓MSC的特點(diǎn),例如成纖維樣形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞周期狀態(tài)、以及脂肪和成骨分化潛能和促進(jìn)造血的功能。但臍帶MSC形成CFU-F的能力要顯著優(yōu)于骨髓MSC,增殖能力更強(qiáng),脂肪分化能力更弱。此外,臍帶MSC細(xì)胞因子分泌譜除了表達(dá)骨髓MSC相關(guān)細(xì)胞因子外,還表達(dá)GM-CSF和G-CSF,并特異性表達(dá)人白細(xì)胞分化抗原HLA-G和神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF[6]。

3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在疾病治療中的作用及相關(guān)機(jī)制

間充質(zhì)干細(xì)胞因其多潛能和可擴(kuò)增性對(duì)再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了不可估量的影響。在細(xì)胞治療、組織工程以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi),間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞可應(yīng)用于修復(fù)/替代受傷或病變的多種組織器官,從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病如脊髓受傷、多發(fā)性硬化(MS)、老年性癡呆、帕金森氏癥等提供了嶄新的治療方案。

除了間充質(zhì)干細(xì)胞的可塑性外,MSC的免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制功能尤其值得關(guān)注。其中骨髓MSC通過自我更新、多向分化和分泌多種效應(yīng)因子如透明質(zhì)酸等構(gòu)建起穩(wěn)定的造血微環(huán)境,在造血干細(xì)胞的生長、增殖、分化中發(fā)揮重要作用[7]。實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎的動(dòng)物試驗(yàn)證明,MSC可以移入中樞神經(jīng)系統(tǒng),通過發(fā)揮免疫抑制功能,保護(hù)正常神經(jīng)元的功能。對(duì)于眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病而言,MSC發(fā)揮抗凋亡、抗炎癥的功能主要是招募、誘導(dǎo)局部組織中的前體細(xì)胞向神經(jīng)元的分化,而并不依賴MSC自身向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。骨髓MSC治療缺血性心臟病(如心肌梗塞)、腦梗塞和脊髓損傷的研究證實(shí),MSC能夠改善心臟和腦組織功能,主要機(jī)制是通過分泌SDF-1和VEGF等局部細(xì)胞因子,誘導(dǎo)微血管的生成,改善缺血組織微環(huán)境。體外試驗(yàn)證實(shí)MSC能被誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞,并表達(dá)肌鈣蛋白Ⅰ和肌間蛋白[8]。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型中,MSC可以加速胰島再生,促進(jìn)腎小球腎炎的恢復(fù)。當(dāng)MSC和骨髓細(xì)胞共同移植時(shí),MSC可以有效抑制胰島β細(xì)胞特異性T細(xì)胞增殖,通過促進(jìn)內(nèi)源性胰島β細(xì)胞再生,恢復(fù)胰島功能,維持血糖水平穩(wěn)定[9]。

臍帶MSC的臨床研究相對(duì)滯后,但目前的研究證實(shí)臍帶MSC作為滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚胎干細(xì)胞的增殖分化同樣起到支撐作用,其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF有利于維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。在條件性的神經(jīng)元培養(yǎng)基內(nèi)臍帶MSC可以被誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)元β-微管蛋白和星型膠質(zhì)細(xì)胞蛋白GFAP[10]。Campard等[11]用肝細(xì)胞生長因子通過兩步法在體外有效地誘導(dǎo)出臍帶MSC向肝細(xì)胞的分化,被誘導(dǎo)的細(xì)胞在形態(tài)和分子標(biāo)記物上都具有肝細(xì)胞特征。通過白蛋白和尿素分泌、糖元貯積、低密度脂蛋白攝取和細(xì)胞色素P450活化研究,進(jìn)一步證明了人的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠被分化誘導(dǎo)成有功能的肝細(xì)胞。作為穩(wěn)定、有效的基因載體,臍帶MSC介導(dǎo)的干擾素β靶向基因治療動(dòng)物試驗(yàn)顯示,臍帶MSC能夠攜帶靶基因定向進(jìn)入癌癥組織,有效減少實(shí)體腫瘤體積[12]。

English等[13]對(duì)MSC抑制免疫排斥反應(yīng)的機(jī)制研究證實(shí),MSC可以從多層次對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞等的激活和增殖具有抑制作用。表現(xiàn)在:影響DC細(xì)胞的移位、成熟,降低T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別能力,與NK細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合,誘導(dǎo)NK細(xì)胞的免疫耐受等。MSC發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)與抑制炎性因子IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生密切相關(guān)。MSC進(jìn)入機(jī)體優(yōu)勢分布于受損部位,促進(jìn)其功能恢復(fù)。但更多的機(jī)制表明MSC并沒有直接參與組織再生,而是為其它細(xì)胞的增殖分化提供良好的微環(huán)境。因此進(jìn)入機(jī)體的間充質(zhì)干細(xì)胞是否能定向進(jìn)入機(jī)體受損部位、正常分化為組織細(xì)胞?是否會(huì)發(fā)生與器官移植相似的急性免疫排斥反應(yīng)等問題就顯得尤為重要。

4 結(jié)語及展望

近年來,細(xì)胞(或組織)替代治療和基因治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)和前沿,為人類征服多種疾病提供了希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)容易分離培養(yǎng)、體外可大量擴(kuò)增、遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定、體內(nèi)植入反應(yīng)弱,易于接受外源基因的導(dǎo)入和表達(dá),而被認(rèn)為是一種較為理想的組織工程和基因載體細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究是傳統(tǒng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的新生力量,與傳統(tǒng)的骨髓源MSC比較,臍帶源MSC的絕大多數(shù)生物學(xué)特征與骨髓源MSC相似,但在增殖能力、CFU-F頻率、CD106、HLA-Ⅰ表達(dá)和神經(jīng)誘導(dǎo)分化能力等方面甚至要優(yōu)于骨髓源MSC。同時(shí)臍帶來源廣泛,便于取材,對(duì)供者無不利影響,不影響臍帶造血干細(xì)胞的保存,無道德倫理問題的限制。因此,作為一種新型種子細(xì)胞,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用具有更廣闊的前景。

依據(jù)MSC的移植來源不同,有自體和異體之分。臨床上的某些危急時(shí)刻異體MSC更省事、省力。而某些亞急性狀態(tài)下,自體MSC更安全。就MSC的安全性而言,即使來源于自身免疫系統(tǒng)疾病患者的MSC也具有正常的表型和分子標(biāo)記,體內(nèi)環(huán)境下MSC抑制T細(xì)胞過度增殖功能的缺乏,并非是MSC自身免疫調(diào)節(jié)功能的異常,而是骨髓內(nèi)微環(huán)境的紊亂。因此MSC發(fā)揮免疫功能的完整性更具有保證。

但目前間充質(zhì)干細(xì)胞的研究仍存在迫切需要解決的問題。例如因組織來源、試劑使用、培養(yǎng)條件、血清使用、添加細(xì)胞因子種類、細(xì)胞培養(yǎng)密度等不同,造成不同實(shí)驗(yàn)室的同一組織來源干細(xì)胞的細(xì)胞表型、起始細(xì)胞異質(zhì)性、分化能力、增殖能力、長期培養(yǎng)后的細(xì)胞功能等存在較大差異,直接影響了間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用[14]。因此,急需將間充質(zhì)干細(xì)胞的取材、分離、培養(yǎng)和鑒定方法等標(biāo)準(zhǔn)化,研發(fā)新的試劑、鑒定表型標(biāo)志和建立統(tǒng)一的原始細(xì)胞質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),從而加速間充質(zhì)干細(xì)胞的研究。另外MSC的腫瘤原性也值得關(guān)注,一方面MSC通過轉(zhuǎn)化為腫瘤基質(zhì)促進(jìn)腫瘤生長;另一方面,MSC的免疫抑制功能也是其促腫瘤效應(yīng)的必要條件。但最新的“touch and go”理論認(rèn)為MSC進(jìn)入機(jī)體后迅速移位于受損組織,隨后又很快被壓力誘導(dǎo)的“治療因子”所清除,因此應(yīng)用中安全性較高。綜上所述,臍帶源MSC作為間充質(zhì)干細(xì)胞的新生代表,在進(jìn)一步完善其作用機(jī)制和臨床研究的基礎(chǔ)上,會(huì)擁有更為廣泛的應(yīng)用前景。

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