趙彥斌，孫兆增，胡仲明，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071)

研究報告

黑線倉鼠及其白化突變系毛囊中黑色素細(xì)胞的組織學(xué)分析

趙彥斌，孫兆增，胡仲明，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071)

目的黑線倉鼠白化突變系是一種新的實驗動物模型，本研究旨在組織水平上觀察黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織中黑色素細(xì)胞的分布與定位，以揭示黑線倉鼠白化突變系發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。方法本實驗選擇黑線倉鼠和白化突變系各6只，取背部皮膚，制備石蠟切片，分別采用多巴染色、多巴-甲苯胺藍(lán)復(fù)染，光鏡觀察、拍照。結(jié)果Dopa染色顯示，在黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織中均有成熟黑色素細(xì)胞的分布，主要存在于毛囊毛乳頭中，且黑線倉鼠黑色素陽性區(qū)要明顯高于白化突變系。結(jié)論黑線倉鼠的酪氨酸酶活性要高于白化突變系。

黑線倉鼠;白化突變;毛囊;黑色素細(xì)胞

用普通的HE染色，黑色素顆粒不能清楚地顯示，黑色素細(xì)胞的病理診斷很困難，因此，須選擇特異性強(qiáng)、操作較為方便和效果好的染色方法來觀察黑色素細(xì)胞。本文采用了多巴染色法，多巴是黑色素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的特異性底物［1］，多巴色素呈棕黑色，這是黑色素細(xì)胞多巴染色的生物化學(xué)基礎(chǔ)。酪氨酸酶是黑色素形成的關(guān)鍵酶，其表達(dá)和活性決定著黑色素生成的速度和產(chǎn)量［2］。組織化學(xué)水平研究黑色素細(xì)胞的數(shù)量和分布，主要是通過酪氨酸酶作為分子標(biāo)記來進(jìn)行的。

本研究采用多巴、多巴-甲苯胺藍(lán)聯(lián)合染色方法［3］，研究黑線倉鼠及其白化突變系皮膚組織中成熟黑色素細(xì)胞的分布情況，以期揭示黑線倉鼠白化突變系發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

黑線倉鼠與白化黑線倉鼠各6只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，背部同一位置取一小塊皮膚，立即用10%甲醛固定，備用。

1.2 主要試劑配制

0.1 mol/L，pH7.4磷酸鹽緩沖液:A液:0.1 mol/L磷酸氧二鈉35.8 g溶解于1000 mL雙蒸水;B液:磷酸二氧鉀13.6 g溶解于1000 mL雙蒸水;取A液9份與 B液1份混合，pH調(diào)至 7.4;0.0056 mol/L多巴孵育液:0.11 g多巴溶于0.1 mol/L，pH7.4磷酸鹽緩沖液，定容于100 mL;Bouin氏液:飽和苦味酸水溶液75份，40%甲醛25份，冰醋酸5份;0.5%甲苯胺藍(lán)配制:取0.5 g甲苯胺藍(lán)，雙蒸水溶解，定容于100 mL。

1.3 方法

1.3.1 多巴染色:取新鮮皮膚小塊，用10%甲醛溶液固定6 h(4℃)，修切已固定的組織塊，厚約3～5 mm，皮膚取材切面必須與毛干平行，應(yīng)以順毛根方向修切組織塊，以縱切為宜。自來水速洗，再經(jīng)蒸餾水浸洗;將組織塊移入孵育液30 min(37℃)待液體變?yōu)椴枭瑩Q入新孵育液孵育6 h(37℃);流水沖洗5 h，在Bonin氏液中重新固定12～24 h，自動脫水機(jī)處理，水洗0.5 h→70%乙醇1 h→80%乙醇1 h→95%乙醇Ⅰ1 h→95%乙醇Ⅱ1 h→無水乙醇Ⅰ0.5 h→無水乙醇Ⅱ0.5 h→二甲苯Ⅰ40 min→二甲苯Ⅱ50 min→浸蠟Ⅰ(加少量二甲苯)0.5 h→浸蠟Ⅱ1.5 h→浸蠟Ⅲ2 h→包埋→切片→脫蠟、透明、封固。

1.3.2 多巴-甲苯胺藍(lán)復(fù)染:按照多巴染色步驟制作切片，脫蠟至水，0.5%甲苯胺藍(lán)染色30 min，切片鏡檢拍照。

2 結(jié)果(圖1～2，見彩插Ⅰ)

多巴是酪氨酸酶的特異性底物，由酪氨酸酶催化生成棕黑色的多巴色素，多巴染色結(jié)果見圖1，鏡檢顯示，黑線倉鼠與白化突變系的皮膚組織中均有多巴的陽性著色，多巴陽性著色顯示的是多巴陽性黑色素細(xì)胞，說明具有成熟黑色素細(xì)胞，在黑線倉鼠與白化突變系皮膚組織中都有分布，但分布數(shù)量不同。黑線倉鼠的多巴反應(yīng)陽性區(qū)要明顯高于白化突變系。

多巴-甲苯胺藍(lán)復(fù)染(圖2)，可以充分顯示多巴陽性黑色素在皮膚組織中的分布，黑線與白化倉鼠皮膚組織中黑色素細(xì)胞主要存在于毛囊的毛乳頭中。

3 討論

多巴染色在研究哺乳動物酪氨酸酶陽性黑色素細(xì)胞的分布、數(shù)量方面具有重要的價值。本研究選用多巴染色技術(shù)研究黑線倉鼠及其白化突變系皮膚組織中的酪氨酸酶陽性黑色素細(xì)胞。Dopa染色顯示，黑線與白化倉鼠皮膚組織中黑色素細(xì)胞主要存在于毛囊毛乳頭中，黑線倉鼠的多巴反應(yīng)陽性區(qū)要明顯高于白化突變系。組織化學(xué)反應(yīng)的陽性結(jié)果間接反應(yīng)了陽性區(qū)域酪氨酸酶活性的高低，而酪氨酸酶活性的高低，可以在一定程度上說明其所在黑色素細(xì)胞色素合成速率的高低［4］，黑線倉鼠與白化突變系毛囊中多巴陽性率的高低，也即酪氨酸酶活性的高低，是導(dǎo)致毛色差異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

白化突變系酪氨酸酶活性發(fā)生了降低，這可能導(dǎo)致其白化的原因，而酪氨酸酶活性的改變往往是發(fā)生了酪氨酸酶基因的突變［5］，本課題接下來擬從黑線倉鼠及其白化突變系酪氨酸酶基因序列、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯后加工運輸和糖基化修飾情況的異同，探討黑線倉鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生的分子機(jī)理。通過該課題，可以進(jìn)一步明確黑線倉鼠白化突變系的遺傳背景，為黑線倉鼠白化突變系在生物醫(yī)學(xué)中的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

［1］ Westerhof W.The discovery of the human melanocyte［J］. Pigment Cell Res，2006，19(3):183－193.

［2］ 潘興華.黑素細(xì)胞及黑素的生成與調(diào)節(jié)［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1998，29(2):179－181.

［3］ 姜俊兵，董常生，賀俊平.不同被毛顏色羊駝皮膚組織中成熟黑色素細(xì)胞的組織學(xué)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010.41(2): 229－133.

［4］ Mani I，Sharma V，Tamboli I，et al.Interaction of melanin with proteins the importance of an acidic intramelanosomal pH［J］. Pigment cell Res，2001.14(3):170－179.

［5］ KwonBS， Haq AK， PomerantzSH， etal. Isolation，chromosomal mapping and expression of mouse Tyrosinase gene.［J］.Invest Dermatol，1989，93:589－594.

Histochemical Study on the Distribution of Melanocytes in Hair Folicle of the Cricetulus barabensis and the Albino Mutant

ZHAO Yan-bin，SUN Zhao-zeng，HU Zhong-ming，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China)

ObjectiveTo observe the distribution of melanocytes in skin of the Cricetulus barabensis and the albino mutant，and to explain the cytologic basis of the the albino mutant。MethodsThe skin of back were surgically separated from six Cricetulus barabensis and the albino mutant，paraffin sections were prepared conventionally.Dopa staining and dopa-toluidine blue staining were executed to obtain the visible information about melanocytes distribution. Results The results showed that the melanocytes were mainly distributed in the dermal papilla of the hair follicles，and the are was more significant in Cricetulus barabensis than the in albino mutant。ConclusionThe tyrosinase activity of the Cricetulus barabensis is higher than the albino mutant.

Cricetulus barabensis;Albino mutant;Hair follicle;Melanoma

R329.25

A

1671-7856(2010)10-0001-02

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.001

2010-06-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(項目批準(zhǔn)號30870347)。

趙彥斌(1984－)，男，碩士生;研究方向:實驗動物學(xué)。

曾林(1965－)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事實驗動物病理學(xué)及大動物生物安全實驗。E-mail:zenglin1965@126.com