吳 巍，滕厚雷

(海南德澤藥物研究有限公司，海南?？?570105)

小檗堿與芒果苷皆為來(lái)源于植物的天然產(chǎn)物，具有抗糖尿病等多種藥理活性。李學(xué)堅(jiān)等［1－3］曾報(bào)道小檗堿與芒果苷配伍具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、降糖的藥理活性，但二者配伍后在細(xì)胞水平的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。該文以葡萄糖攝取為切入點(diǎn)，觀察二者配伍對(duì)葡萄糖攝取的影響，并進(jìn)而研究二者配伍對(duì)葡萄糖攝取信號(hào)通路的影響。以期為進(jìn)一步評(píng)價(jià)二者配伍在治療糖尿病方面的意義提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 芒果苷、鹽酸小檗堿，經(jīng)HPLC鑒定二者純度＞98%;小檗堿配伍芒果苷(將鹽酸小檗堿與芒果苷以摩爾比1∶1配伍，簡(jiǎn)稱BM):海南德澤藥物研究有限公司自制。

大鼠 L6成纖維細(xì)胞(簡(jiǎn)稱 L6細(xì)胞，ATCC)、HGDMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、2-脫氧葡萄糖(Sigma)、［3H］-2-脫氧葡萄糖(Amersham Pharmacia);AMPK磷酸化抗體(Thr172)、AMPK本底抗體、ACC磷酸化抗體(Ser79)均購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L6細(xì)胞培養(yǎng)及分化 置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 2-脫氧葡萄糖攝取 L6細(xì)胞在無(wú)血清的HG-DMEM培養(yǎng)基中饑餓2 h?；衔镆圆煌臐舛忍荻燃拥脚囵B(yǎng)基中孵育2.5 h，然后更換含有化合物的 HBS溶液，以1 μmol·L－1的胰島素作為陽(yáng)性對(duì)照，再孵育0.5 h。加入終濃度為0.1 mmol·L－1的二位脫氧葡萄糖和 1.85 ×107Bq·L－1的二位3H同位素標(biāo)記的二位脫氧葡萄糖，用Microbeta儀器閃爍計(jì)數(shù)。測(cè)細(xì)胞裂解液的總蛋白濃度來(lái)定細(xì)胞數(shù)量。以空白對(duì)照孔的葡萄糖吸收數(shù)值為100%，計(jì)算化合物孔及陽(yáng)性對(duì)照孔的葡萄糖吸收百分比。

將芒果苷、小檗堿及BM與陽(yáng)性對(duì)照胰島素的數(shù)據(jù)相比所得的各受試物與胰島素的相對(duì)效力比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以平行對(duì)比芒果苷、小檗堿及BM對(duì)糖攝取的影響。

1.2.3 免疫印跡檢測(cè)AMPK磷酸化水平 L6細(xì)胞在無(wú)血清的HG-DMEM培養(yǎng)基中饑餓3 h。化合物以不同的濃度梯度加到培養(yǎng)基中孵育2～3 h，收樣。SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜，再分別與抗 AMPK-p、AMPK、ACC-p、β-actin的一抗 4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，分別加二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，最后用ECL底物顯影曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 組間比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿與芒果苷配伍對(duì)L6細(xì)胞糖攝取的影響 0.625 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對(duì)效力比分別為(91.26±13.28)%、(61.34±6.08)%、(51.45±7.94)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

1.25 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對(duì)效力比分別為(101.06±4.57)%、(70.77±6.43)%、(52.85±8.09)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.01)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

2.5 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對(duì)效力比分別為(102.13±4.77)%、(91.04±9.58)%、(49.30±5.47)%;BM與小檗堿比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

5 μmol·L－1濃度下，BM、小檗堿、芒果苷與胰島素的相對(duì)效力比分別為(120.47±12.48)%、(98.66±4.19)%、(49.32±2.20)%;BM與小檗堿比差異有顯著性(P＜0.05)，與芒果苷比差異有顯著性(P＜0.01)。

試驗(yàn)結(jié)果表明:BM與小檗堿均能促進(jìn)L6細(xì)胞的葡萄糖攝取，但芒果苷未表現(xiàn)出促葡萄糖攝取作用。BM與芒果苷、小檗堿比較，活性增強(qiáng)，表明芒果苷與小檗堿配伍具有協(xié)同作用。

2.2 小檗堿與芒果苷配伍對(duì)L6細(xì)胞AMPK與ACC磷酸化水平的影響 1.25、2.5、5.0 μmol·L－1BM 能提高 L6 細(xì)胞AMPK及其下游底物ACC的磷酸化水平，呈濃度依賴性。2.5、5.0、10 μmol·L－1小檗堿能提高 L6 細(xì)胞 AMPK 及 ACC的磷酸化水平，呈濃度依賴性。1.0、2.0 μmol·L－1芒果苷未能提高L6細(xì)胞AMPK及ACC的磷酸化水平，4.0 μmol·L－1芒果苷能提高L6細(xì)胞AMPK的磷酸化水平，但未能明顯提高ACC的磷酸化水平。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿、芒果苷可以促進(jìn)L6成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取，機(jī)制是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，增加GLUT的表達(dá)與轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝?。?～7］。

我們的研究結(jié)果亦表明小檗堿、芒果苷可以促進(jìn)AMPK磷酸化，小檗堿可以促L6細(xì)胞葡萄糖攝取，但芒果苷卻未表現(xiàn)出促葡萄糖攝取作用。此項(xiàng)研究結(jié)果的不同，是否與實(shí)驗(yàn)方法不同有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。

在葡萄糖攝取試驗(yàn)中，小檗堿與芒果苷配伍后表現(xiàn)出優(yōu)于各單體的活性作用，表明二者配伍具有協(xié)同作用。為揭示小檗堿與芒果苷的配伍意義，以進(jìn)一步將小檗堿與芒果苷配伍開發(fā)為新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

AMPK是一種異源三聚體蛋白，被稱為細(xì)胞的“代謝感受器”。AMPK的活化能夠調(diào)節(jié)葡萄糖和脂類代謝，抑制胰島素抵抗，對(duì)2型糖尿病患者骨骼肌和肝臟具有明顯的保護(hù)作用。因此，AMPK及其信號(hào)通路極有可能作為研發(fā)新型抗2型糖尿病藥物有效的藥理學(xué)靶點(diǎn)［8］。因此，尋找激活A(yù)MPK的小分子藥物，將是未來(lái)治療2型糖尿病可能的途徑。

小檗堿與芒果苷配伍，可明顯促進(jìn)L6細(xì)胞的葡萄糖攝取與AMPK磷酸化。說(shuō)明小檗堿與芒果苷配伍是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路發(fā)揮促葡萄糖攝取作用的。此研究結(jié)果為將小檗堿與芒果苷配伍的新藥開發(fā)為AMPK激動(dòng)劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝:感謝中科院上海藥物研究所國(guó)家新藥篩選中心李靜雅博士、李佳博士、張薇博士給予的技術(shù)支持。)

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