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        基于炮效關(guān)系研究白芥子鎮(zhèn)咳藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

        2010-11-29 09:24:02馮寶民諶啟鵬王惠國史麗穎王永奇苑艷霞
        中國藥理學(xué)通報 2010年9期
        關(guān)鍵詞:白芥子炮制羥基

        馮寶民,邱 琳,諶啟鵬,王惠國,史麗穎,蔣 革,唐 玲,王永奇,苑艷霞

        中藥炮制是體現(xiàn)中醫(yī)用藥特點的主要內(nèi)容之一,直接關(guān)系到臨床用藥的療效。有些藥物必須進(jìn)行炮制,有效成分才能溶出,有些藥物經(jīng)炮制后,有效成分的溶出率明顯增加,因此,中藥的功效與其炮制方法有著極為密切的聯(lián)系。

        白芥子為為十字花科(Cruciferae)芥屬植物白芥Sinapis alba L.的種子,辛,溫,歸肺經(jīng),臨床入藥常以炒黃法炮制[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:炒白芥子的鎮(zhèn)咳作用優(yōu)于生白芥子[2-3],提示炒制法可以提高白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分的溶出率。為明確白芥子鎮(zhèn)咳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究前期從炒白芥子中分離得到了10個化合物,分別鑒定為4-羥基苯乙酸-2′-醛基-5′-呋喃甲酯(Ⅰ)、對羥苯基乙腈(Ⅱ)、對羥基苯甲醛(Ⅲ)、胡蘿卜苷(Ⅳ)、軟脂酸-1-單甘油酯(Ⅴ)、β-谷甾醇(Ⅵ)、芥子酸(Ⅶ)、對羥基苯甲酸(Ⅷ)、對羥基苯乙酸(Ⅸ)和雙(5-甲?;坊?醚(Ⅹ)[4]。HPLC 研究結(jié)果顯示,上述成分中,對羥基苯乙腈含量在炒制后明顯增加。對羥基苯乙腈的氰基結(jié)構(gòu)可能在體內(nèi)經(jīng)過Ⅰ相酶系的作用產(chǎn)生氰化氫(HCN),從而起到中樞鎮(zhèn)咳作用[5],因此,本研究擬分離純化對羥基苯乙腈并對其鎮(zhèn)咳作用進(jìn)行研究,為白芥子炮制機(jī)制及白芥子鎮(zhèn)咳活性成分的研究提供實驗依據(jù)。

        1 儀器與材料

        XT4A顯微熔點測定儀,JEOL JNM-AL400型、Bruker ARX-500型核磁共振儀,JEOL JMS-700型質(zhì)譜儀,Waters 515高效液相色譜儀,Waters 2487 Dual λ紫外檢測器,Chromstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),BP210s 1/1萬電子天平(Sartorius公司),BP211s 1/10萬電子天平(Sartorius公司),Laborato 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph公司),秒表(深圳追日電子公司)。

        白芥子購自河北安國,經(jīng)大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院高松副教授鑒定為十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟種子。氨水(安徽宿州化學(xué)試劑廠),10~40 μm薄層色譜用硅膠、200~300目柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)。

        昆明種小白鼠,♀♂各半,體質(zhì)量(20±2)g,購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

        2 方法

        2.1 炒制前后白芥子中對羥基苯乙腈含量的比較

        炒白芥子的制備:取凈白芥子,分別用文火加熱5、10 min,炒至表面呈黃色,有爆裂聲,并放出香辣氣味,取出,放涼。

        色譜柱條件:色譜柱為Luna 5u Pheny1-Hexy1(250 mm ×4.60 mm,5 μm);流動相為甲醇 -水(35∶65,V/V)流速0.6 ml·min-1;檢測波長287 nm。

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取對羥基苯乙腈對照品加甲醇溶解并定容至質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg·L-1的溶液。精密吸取各溶液 10 μl,注入液相色譜儀,測得進(jìn)樣濃度(X)對峰面積(Y)的直線回歸方程。

        供試品溶液的制備:取生白芥子與5 min炒白芥子、10 min炒白芥子,各20 g,粉碎,石油醚脫脂,過濾,藥渣用0.95乙醇回流提取3次,合并提取液;濃縮至無醇味,得其浸膏,分別精密稱取樣品的浸膏0.1 g,加甲醇溶解并定容至50 ml,得濃度為2 g·L-1的溶液,備用。

        樣品測定:分別精密吸取各供試品溶液10 μl,注入液相色譜儀,按上述條件測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出含量。

        2.2 實驗動物的篩選及引咳實驗 動物篩選:將小鼠放入倒置的燒杯內(nèi),迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球,5 s后立即取出,2 min內(nèi)不咳嗽者舍去。

        引咳實驗:在篩選實驗結(jié)束7 d后,隨機(jī)分組,給藥結(jié)束后,將小鼠放在倒置的600 ml的燒杯內(nèi),迅速放入注有1.0 ml濃氨水的棉球,一熏一換氨水球,每次熏1只小鼠。記錄放入時間,觀察并記錄咳嗽潛伏期,并記錄2 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)。

        2.3 白芥子炒制前后鎮(zhèn)咳作用比較 實驗動物灌胃給藥。分組及給藥劑量如下:A陰性對照組(蒸餾水0.5 ml·d-1)、B生白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1生白芥子生藥醇提液)、C炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液)。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d,在d 7給藥30 min后,參照“2.2”進(jìn)行引咳實驗。

        2.4 對羥基苯乙腈的制備 取炒白芥子5.0 kg,粉碎,用石油醚(60℃ ~90℃)室溫冷浸脫脂3次(每次24 h),晾干,以0.95乙醇回流提取,合并提取液,減壓回收乙醇至無醇味,得浸膏733 g;該浸膏加入7 L蒸餾水溶解分散后,依次用1/3體積的醋酸乙酯萃取4次,回收溶劑,得醋酸乙酯萃取物200 g,經(jīng)多次柱色譜分離及重結(jié)晶得到對羥基苯乙腈化合物。

        2.5 對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 實驗動物灌胃給藥。分組及給藥劑量如Tab 3:A炒白芥子組(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生藥的醇提液,其中含對羥基苯乙腈0.022 5 g·kg-1·d-1),B對羥基苯乙腈低劑量組,C對羥基苯乙腈中劑量組,D對羥基苯乙腈高劑量組。在d 7給藥30 min后,參照“2.2”進(jìn)行引咳實驗。

        2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件處理,首先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗,統(tǒng)計結(jié)果表明,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,但方差不齊,故采用近似t檢驗,即 t′檢驗。

        3 結(jié)果

        3.1 炒制前后白芥子中對羥基苯乙腈含量的變化

        進(jìn)樣濃度(X)對峰面積(Y)的直線回歸方程為^Y=5.841×103X+3.573×103,r=0.999 6;線性范圍0.5~2.5 mg。由Tab 1可見白芥子中對羥基苯乙腈含量隨著炒制時間的延長而增加。白芥子炒制5 min后,其中對羥基苯乙腈的含量是生白芥子的5.5倍,白芥子炒制10 min后其中對羥基苯乙腈的含量是生白芥子的7.5倍。

        Tab 1 Comparison of p-hydroxyphenylacetonitrile content between fresh and roasted sinapis alba seeds

        3.2 炒白芥子與生白芥子鎮(zhèn)咳作用比較 如Tab 2所示,與陰性對照組相比,生白芥子能夠延長實驗動物的咳嗽潛伏期,但抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用不明顯;炒白芥子具有明確的鎮(zhèn)咳作用。與生白芥子相比,相同劑量情況下,炒白芥子延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)的效果均優(yōu)于生白芥子,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

        Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s,n=20)

        Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s,n=20)

        *P<0.05 vs negative control group;#P<0.05 vs fresh seeds of sinapis alba group

        Group Dose/g·kg-1·d-1 Cough latent period/s Cough times in 2min A Negative - 6.229±2.274 27.357±9.312 B Fresh sinapis alba seeds 4.500 14.243±3.471* 23.125±8.413 C Roasted sinapis alba seeds 4.500 25.774±6.903*#15.800±3.942*#

        3.3 對羥基苯乙腈的制備 200 g醋酸乙酯萃取物經(jīng)多次柱色譜分離及重結(jié)晶得到無色棱柱狀結(jié)晶,mp 66℃ ~ 67℃ (氯仿)。EI-MS m/z:133[M+],132,106,105,78,77,51,50,39。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.15(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.83(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),5.87(1H,brs,-OH),3.62(2H,s,H-2)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:155.4(C-4′),129.1(C-2′,6′),121.3(C-1′),118.2(-CN),115.9(C-3′,5′),22.9(C-2)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)[6]及 Sadtler光譜[7]中對羥基苯乙腈對照基本一致,故鑒定其為對羥基苯乙腈。

        3.4 對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳作用研究 由Tab 3可知,與陰性對照A組相比,對羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與B炒白芥子組相比,對羥基苯乙腈的低劑量組與炒白芥子鎮(zhèn)咳效果相當(dāng),對羥基苯乙腈的中劑量組,其抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果優(yōu)于炒白芥子,對羥基苯乙腈的高劑量組,其延長實驗動物引喘潛伏期、抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用均優(yōu)于炒白芥子。

        Tab 3 The antitussive effect of p-hydroxyphenylacetonitrile(n=6)

        4 討論

        中藥炮制工藝是中醫(yī)臨床用藥的一大特色。中藥在炮制過程中發(fā)生了某些成分的變化,因而導(dǎo)致其藥理活性的變化。研究中藥材的炮效關(guān)系對于分析中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定的指導(dǎo)意義。

        白芥子臨床入藥以炒制法為主,本研究結(jié)果顯示,炒白芥子鎮(zhèn)咳活性明顯優(yōu)于生白芥子,這說明炒制法可以提高白芥子中鎮(zhèn)咳藥效成分含量。我們對炒白芥子和生白芥子的化學(xué)成分進(jìn)行對比分析,結(jié)果顯示,炒制后對羥基苯乙腈含量明顯增加,白芥子炒制10 min后,其中對羥基苯乙腈含量是炒制前的7.5倍。依據(jù)炮效關(guān)系進(jìn)行分析,對羥基苯乙腈很可能是白芥子鎮(zhèn)咳的藥效成分,本研究在此基礎(chǔ)上,分離純化出對羥基苯乙腈并對其鎮(zhèn)咳作用進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),對羥基苯乙腈具有明確的鎮(zhèn)咳作用,其延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果明顯優(yōu)于空白對照組,可以確定對羥基苯乙腈為白芥子鎮(zhèn)咳藥效成分。對羥基苯乙腈在延長實驗動物咳嗽潛伏期方面具有一定的量效關(guān)系,中劑量的對羥基苯乙腈抑制實驗動物2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)作用效果優(yōu)于炒白芥子。高劑量的對羥基苯乙腈鎮(zhèn)咳效果尤為明顯,其延長實驗動物咳嗽潛伏期、抑制2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)效果均優(yōu)于炒白芥子,組間差異有顯著性(P<0.05)。

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