韓承業(yè)，余世袁，歐陽嘉，李鑫，周娟，許艷

南京林業(yè)大學 林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室，南京 210037

定點突變提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的穩(wěn)定性

韓承業(yè)，余世袁，歐陽嘉，李鑫，周娟，許艷

南京林業(yè)大學 林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室，南京 210037

通過定點突變的方法，在來源于里氏木霉Trichderma reesei的木聚糖酶XYN II的N-末端兩個β折疊片層間添加二硫鍵，以提高木聚糖酶的穩(wěn)定性。原酶XYN-OU和突變酶XYN-HA12 (T2C、T28C和S156F) 分別在畢赤酵母中分泌表達，突變酶與原酶純化后進行酶學性質比較。結果表明：突變酶最適反應溫度由50℃提高到60℃；在70℃的半衰期由1 min提高到14 min；最適反應pH為5.0，與原酶保持一致，但是在50℃、30 min條件下的pH穩(wěn)定范圍由4.0~9.0擴展到3.0~10.0。對木聚糖酶分子改良的結果反映出在β片層間添加二硫鍵可以有效改善酶在較高溫度下三維結構的剛性，提高熱穩(wěn)定性。

定點突變，木聚糖酶，熱穩(wěn)定性，里氏木霉

近年來，隨著木聚糖酶晶體結構的解析和人類對蛋白質分子功效的認識不斷深入，對酶進行分子改良已成為可能。采用基因工程手段提高木聚糖酶穩(wěn)定性的研究得到不斷地發(fā)展。Stephens等[3]采用易錯PCR的定向進化手段挑選熱穩(wěn)定性更好的菌株，得到的耐熱菌株在70℃的半衰期由原始菌株的89 min提高到 215 min；Sriprang等[4]采用精氨酸取代Aspergillus niger BBC14405表面的絲氨酸/蘇氨酸，提高了酶的熱穩(wěn)定性。許多研究結果表明G/11家族木聚糖酶的 N-末端區(qū)域和二硫鍵的添加對于 G/11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性起著很重要的作用。楊浩盟等[5]通過 N-末端氨基酸的點突變 (N13D和 S40E)替換將橄欖綠鏈霉菌 Streptomyces olivaceoviridis木聚糖酶熱穩(wěn)性提高了24.76%；Georis等[6]通過提高 N-末端芳香族氨基酸間的相互作用來增強Streptomyces的熱穩(wěn)性；Sun等[7]用耐熱性木聚糖酶TfxA的N-末端區(qū)域替換黑曲霉Aspergillus niger木聚糖酶A的N-末端相應區(qū)域，使其最適反應溫度提高 10℃；Wakarchuk等[8]在芽胞桿菌 Bacillus circulans木聚糖酶的 N-和 C-區(qū)域構建了一個二硫鍵使該木聚糖酶熱穩(wěn)性提高大于 10℃；Jeong等[9]在脂肪嗜熱芽胞桿菌 Bacillus stearothermophilus No. 236木聚糖酶內部構建一個二硫鍵，使木聚糖酶XynA 的熱穩(wěn)性提高 5℃。Fenel等[10]在里氏木霉Trichoderma reesei XYN II的N-末端構建一個二硫鍵，并延長C-末端使酶的最適溫度提高10℃，本研究受其啟發(fā)在酶的N-末端構建二硫鍵，并通過156位點的突變大幅度地提高了酶活力。

來源于里氏木霉的木聚糖酶 XYN II是屬于G/11家族木聚糖酶，適合應用于生物漂白過程。重組木聚糖酶XYN II對麥草漿CEH的輔助漂白，在保證紙漿白度略有提高的前提下，可以降低氯化段有效氯使用量50%以上[11]。但熱穩(wěn)定性較差是它在應用中的不足。本研究針對上述問題，通過定點突變的方法在木聚糖酶的N-末端構建了一個二硫鍵，以期提高XYN II的熱穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒

木聚糖酶基因xyn II由本實驗室從Trichoderma reesei中獲得并構建在重組畢赤酵母表達載體pPIC9K-xyn II上[12]；菌株大腸桿菌Escherichia coli DH5α、載體 pPIC9K (Amp+，Kan+) 均由本實驗室保存；畢赤酵母菌株 GS115 (His?) 購自 Invitrogen公司。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基 LB，畢赤酵母培養(yǎng)基 YPD、MM、MD、BMGY和BMMY (配方參見Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊)。

1.3 工具酶和生化試劑

多重定點突變試劑盒 (QuikChange?multi site-directed mutagenesis kit) 為 Stratagene公司產品；限制性內切酶Sal I、DNA分子量標準和質粒提取試劑盒為 TaKaRa公司產品；蛋白質分子量標準為MBI公司產品；酵母粉和蛋白胨為英國OXOID公司產品；YNB購自上海晶美生物公司；可溶性木聚糖4-O-Me-D-glucurono- D-xylan (From birchwood)和Bradford 試劑為Sigma公司產品；其他化學試劑均為國產分析純。

1.4 定點突變

采用Stratagene公司的多重定點突變試劑盒，以重組質粒pPIC9K-xyn II為模板，突變引物 (表1) 設計用Stratagene公司的在線引物設計軟件。反應體系含2.5 μL 10× QuikChange?Multi reaction buffer、0.75 μL QuikSolution、1 μL dNTP mix、1 μL 10× QuikChange?Multi enzymes blend，各引物 (T2C、T28C、S156F) 的量均為10 pmol。PCR條件：95℃預變性1 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，65℃延伸 20 min。PCR產物經 Dpn I消化，轉化XL10-Gold感受態(tài)細胞，涂布在含氨芐青霉素LB平板上。具體操作步驟參見Stratagene公司多重定點突變試劑盒的說明手冊。挑取陽性克隆子培養(yǎng)并提取質粒，送金思特 (南京) 有限公司進行測序。

表1 突變引物Table 1 Mutated primers

1.5 重組木聚糖酶工程菌的構建與表達

1.5.1 畢赤酵母的轉化與篩選

將突變質粒pPIC9K-ha12用Sal I單酶切使之線性化，電擊轉化畢赤酵母 GS115，轉化液涂布于不含組氨酸的MD平板，30℃條件下培養(yǎng)至轉化子出現(xiàn)。挑取轉化子，點種到含 0、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 g/L G418的YPD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2 d，在高濃度G418平板上生長的為高拷貝陽性轉化子用于后續(xù)發(fā)酵表達。電轉化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊。

1.5.2 重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達

將陽性轉化子接種于含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，30℃、260 r/min搖床培養(yǎng)到OD600至2.0~6.0。離心收集菌體，用一定體積的BMMY重懸菌體，使其OD600大約在1.0，30℃、260 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補加適量甲醇至體積分數(shù)1%。每12 h取樣，離心5 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.6 重組木聚糖酶的純化

收集酵母發(fā)酵上清液，以分子量為10 kDa的超濾管 (Sartorius stedim biotech gmbH)，濾去小分子量蛋白和鹽，經過分子篩Superdex 75 prep grade純化，上樣量為2 mL，使用去離子水，流速0.5 mL/min洗脫，分布收集洗脫峰中的樣品，經過酶活測定，確定目的樣品所在的收集管，得到電泳純的目標蛋白。純化倍數(shù)計算公式：純化酶比酶活÷粗酶比酶活；酶活回收率計算公式：(純化酶比酶活×純化酶蛋白濃度×純化酶體積) ÷ (粗酶比酶活×粗酶蛋白濃度×粗酶體積) ×100%。利用Bradford法[13]測定蛋白含量；SDS-PAGE方法見參考文獻[14]。

1.7 蛋白的去糖基化處理

樣品采用Endo Hf(New England BioLabs) 進行去糖基化處理。反應條件如下：將20 μg糖蛋白于1倍糖蛋白變性緩沖液中100℃煮沸10 min使其變性；加入1/10體積10倍G5緩沖液；加入1~5 μL Endo Hf，37℃條件下溫育1 h，然后進行電泳鑒定。

1.8 木聚糖酶酶活測定

酶活定義以樺木木聚糖 (Sigma公司) 為底物每分鐘產生1 μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位 (1 IU)。采用DNS定糖法測定木聚糖酶的活性[15]。

2 結果與分析

2.1 突變位點的確定

來源于里氏木霉的木聚糖酶XYN II是屬于G/11家族木聚糖酶，這個家族的空間結構類似于右手半握形狀：由2個β-折疊片層和1個α-螺旋組成[16]，折疊片層大部分是由反平行 β-折疊所組成的。兩個β-折疊片層的疏水面堆積在一起形成三明治形狀，稱為“手指”形狀。有報道稱在木聚糖酶的N-末端添加二硫鍵可以提高酶的熱穩(wěn)定性[10]，而且分析木聚糖酶XYN II結構發(fā)現(xiàn)其分子結構中不含二硫鍵。同時考慮到N-末端遠離催化活性位點，添加二硫鍵不會影響其催化活性。木聚糖酶XYN II的第2位和第28位的蘇氨酸分別位于2個平行的β-折疊片上，將其突變?yōu)榘腚装彼?，從而形成了一個分子內的二硫鍵，加固了木聚糖酶的結構，使其在極端的環(huán)境中，能夠較好地維持結構穩(wěn)定性，保證了其性質上的穩(wěn)定。文獻[7]中所報道的重組木聚糖酶 (即本實驗中的木聚糖酶) 其最大酶活為 1.45 IU/mL，這與文獻[17]中報道的9.58 IU/mL的酶活有較大的差距。將2個酶的基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)只有156位點存在差異。因此將156位點的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，提高酶的疏水性，增強酶和底物的相互作用，以期提高酶活。所用木聚糖酶結構及各突變位點如圖 1所示。

2.2 定點突變

以pPIC9K-xyn II為模板，通過PCR擴增，Dpn I酶消化，使生成的帶3個突變的單鏈環(huán)，轉化進 E. coli，形成雙鏈重組表達質粒。構建出pPIC9K-ha12。通過測序分析，確定突變位點與目標設計的突變位點一致。

圖1 木聚糖酶XYN II結構及各突變位點Fig. 1 Structure of xylanase XYN II and the mutated site.

2.3 重組木聚糖酶菌株的篩選、表達和重組木聚糖酶的純化

2.3.1 重組木聚糖酶菌株的篩選、表達

將突變質粒pPIC9K-ha12用Sal I單酶切使之線性化后電擊轉化畢赤酵母GS115，在MD篩選培養(yǎng)基上篩選得到100個陽性轉化子，進一步點種于含有不同濃度梯度 G418的 YPD平板上，獲得了35個陽性轉化子。采用BMMY培養(yǎng)基分別誘導表達這些陽性轉化子，測定酶活，獲得高表達菌株P. pastoris OU and P. pastoris HA12 (見表2)。

表2 重組木聚糖酶XYN IITable 2 Combination of XYN II mutations

以1%甲醇為碳源誘導表達重組畢赤酵母，誘導48 h后停止，離心得到粗酶液。粗酶液的酶活力分別為 XYN-OU：(3.202±0.08) IU/mL，XYN-HA12：(28.591±0.97) IU/mL；酶蛋白量分別為XYN-OU：(0.066±0.002) mg/mL，XYN-HA12：(0.154±0.006) mg/mL；比酶活分別為 XYN-OU：48.52 IU/mg，XYN-HA12：185.66 IU/mg。

2.3.2 重組木聚糖酶的純化

收集酵母發(fā)酵上清液 (圖2A)，以分子量為10 kDa的超濾管，濾去小分子量蛋白和鹽，然后經過分子篩Superdex 75 prep grade純化，重組木聚糖原酶XYN-OU和重組突變酶XYN-HA12的主要純化結果見表3。其中原酶XYN-OU的純化倍數(shù)為4.2，酶活回收率為31.31%；突變酶XYN-HA12的純化倍數(shù)和酶活回收率分別為4.6和23.94%。對純化酶SDS-PAGE鑒定結果顯示，經過FPLC (Fast protein liquid chromatography) 分離后，原酶XYN-OU達到電泳純；純化后的突變酶HA12在電泳圖譜中顯示2條帶，對樣品進行去糖基化處理后進行電泳鑒定(圖 2B)，發(fā)現(xiàn)圖譜中只顯示一條帶。畢赤酵母在表達外源蛋白時會出現(xiàn)不同程度的糖基化修飾，說明另外一條帶是糖基化的木聚糖酶。里氏木霉產木聚糖酶的分子量為20.3 kDa[14]，而重組木聚糖酶的分子量為 21 kDa。從表 3的數(shù)據可以看出，突變酶XYN-HA12的比酶活比XYN-OU的高很多。

圖2 酶液的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of xylanase. (A) The crude xylanase. M: protein marker; 1: XYN-OU; 2: XYN-HA12. (B) The purified xylanase. M: protein marker; 3: XYN-HA12; 4: XYN-OU; 5: deglycosylation enzyme XYN-HA12; 6: deglycosylase.

表3 野生酶和突變酶的比較Table 3 Comparison of xylanase from the wild type and the mutant enzymes

2.4 突變酶與原酶酶學性質的比較

2.4.1 最適反應溫度和熱穩(wěn)定性

溫度對木聚糖酶酶活的影響如圖3A所示，突變酶XYN-HA12在55℃~65℃時酶活較高，最適反應溫度為60℃，比原酶XYN-OU的最適反應溫度升高了10℃。突變酶在65℃時相對酶活達95.56%，比原酶的27.65%提高很多；在70℃條件下突變酶的相對酶活為 68.07%，相比原酶的14.68%，酶活也有較大程度提高。突變酶XYN-HA12所加的二硫鍵加固了XYN II N-末端的2個β折疊片，當溫度發(fā)生改變時，酶構象的變化速率將降低，或者說酶構象對溫度的變化不敏感，因此，突變酶的耐熱性有很大的提高。

實驗結果顯示，在70℃條件下，半衰期由原酶XYN-OU的1 min延長到突變后酶XYN-HA12的14 min (數(shù)據未顯示)。熱穩(wěn)定性實驗如圖3B所示，在60℃條件下，保溫10 min后，原酶XYN-OU的酶活全部喪失，而突變酶XYN-HA12的酶活在保溫10 min后并沒有變化；在70℃條件下，原酶保溫2 min后酶活全部喪失，而突變酶保溫2 min后其相對酶活達81.64%，并且在保溫10 min后，相對酶活還可以保持在66.82%，這充分說明突變后XYN II的熱穩(wěn)性有很大的提高。

2.4.2 最適反應pH和pH穩(wěn)定性

用100 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配置不同pH的1.0%木聚糖底物測定酶活，結果如圖4A所示。pH 5.0~6.0之間突變酶和原酶的相對酶活處在同一個水平，證明該酶在此范圍內對pH不敏感，從圖4A中可以看出2個酶的最適pH基本相同，pH 5.0~6.0時具有較高酶活。

圖3 原酶與突變酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)性比較Fig. 3 Comparison of the optimum temperature and thermostability between the native and mutated xylanase. (A) Comparison of the optimum temperature. (B) Comparison of the thermostability.

將純化木聚糖酶置于不同pH緩沖液 (pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0時采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH為9.0和10.0時采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液) 中，在50℃下放置30 min后測定酶活(pH 5.0，50℃)，考察突變酶與原酶在50℃下的pH穩(wěn)定性。實驗結果如圖4B所示，原酶在pH 4.0~9.0之間相對酶活都保持在 50%以上，而突變酶在3.0~10.0之間的相對酶活都保持在50%以上，很明顯比原酶的pH穩(wěn)定性范圍擴大了。值得注意的是，pH 9.0時的相對酶活都較pH 8.0時的大，可能與所用緩沖液不同有關。

圖4 原酶與突變酶的最適pH和pH穩(wěn)定性比較Fig. 4 Comparison of the optimum pH value and pH stability between the native and the mutated xylanase. (A) Comparison of the optimum pH. (B) Comparison of the pH stability.

3 討論

本研究中的突變酶相對于原酶來說，比酶活由原來的48.52 IU/mg提高到185.66 IU/mg，酶活的提高與156位點的突變有很大關系，由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，提高了酶的疏水性，增強了酶和底物的相互作用。最適反應溫度由 50℃提高到 60℃，在70℃的半衰期由1 min提高到14 min，在50℃無底物條件下的pH穩(wěn)定范圍由4.0~9.0擴展到3.0~10.0，而最適pH沒有變化，保持在pH 5.0。二硫鍵的構建，可能使得酶蛋白的結構更加穩(wěn)定，在極端的環(huán)境中能夠減緩酶結構變化的速率[18]。使木聚糖酶XYN II適宜應用于生物漂白過程。

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Enhancing stability of Trichoderma reesei xylanase (XYN II) by site-directed mutagenesis

Chengye Han, Shiyuan Yu, Jia Ouyang, Xin Li, Juan Zhou, and Yan Xu

Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology, Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

We engineered a disulphide bridge between two adjacent double-layered β-sheet at the N-terminal region of Trichoderma reesei endo-1,4-β-xylanase II(XYN II) by site-directed mutagenesis. The native xylanase XYN-OU and the mutated xylanase XYN-HA12 (T2C, T28C and S156F) were separately expressed in Pichia pastoris. Both xylanases were purified and characterized. The optimum temperature of XYN-HA12 was increased from 50°C to 60°C, relative to XYN-OU. At 70°C, the halftime of inactivation for XYN-OU and XYN-HA12 were 1 min and 14 min, respectively. The optimum pH of XYN-HA12 was 5.0, similar to XYN-OU. However, XYN-HA12 could retain over 50% activity from pH 3.0 to 10.0 at 50°C for 30 min. As for XYN-OU, it could retain over 50% activity from the pH value 4.0 to 9.0 at 50°C in 30 min. The result of the mutated xylanase indicated that constructed disulphide bridge could improve its thermostability at relatively higher temperature.

site directed mutagenesis, xylanase, thermostability, Trichoderma reesei

木聚糖酶 (EC3.2.1.8) 是一類以內切方式降解木聚糖分子中β-1,4木聚糖苷鍵的酶，可廣泛應用于食品、飼料、釀造、醫(yī)藥和造紙等行業(yè)[1]。在制漿造紙的紙漿漂白工藝中添加木聚糖酶預處理，不僅能夠增加紙張白度，改善紙張性能，還能降低漂白用化學物質用量，有效減輕造紙業(yè)對環(huán)境造成的巨大污染[2]。生物漂白是在 60℃左右、堿性條件下進行紙漿處理，要求用于生物漂白的木聚糖酶在50℃~60℃，pH 9.0~10.0堿性條件下具有較高活性。但是目前木聚糖酶漂白預處理技術的產業(yè)化應用仍然存在一些問題，由于酶在高溫和堿性環(huán)境下不夠穩(wěn)定，其工業(yè)化應用受到限制。因此，提高木聚糖酶穩(wěn)定性的研究十分必要。

November 25, 2009; Accepted: March 15, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2007AA02Z213, 2006AA020204), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707800).

Shiyuan Yu. Tel: +86-25-85427255; Fax: +86-25-85424121; E-mail: syu@njfu.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2007AA02Z213, 2006AA020204)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2007CB707800) 資助。