何曉華,劉世育

(江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 221000)

γ-氨基丁酸對(duì)人末梢血γ δ T細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究

何曉華,劉世育

(江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 221000)

目的研究γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)人外周血γ δ T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡的變化、殺傷活性的影響及其可能的作用機(jī)制。方法在體外用不同濃度的GABA與人γ δ T細(xì)胞作用后,用MT T比色法和流式細(xì)胞儀(FCM)以及乳酸脫氫酶(LDH)法分別檢測(cè)人γ δ T細(xì)胞的增殖能力、T細(xì)胞周期、凋亡和殺傷活性的變化。結(jié)果GABA能顯著抑制γ δ T細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.01),并具有濃度依賴性;GABA顯著影響細(xì)胞周期比例的分布,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;GABA抑制γ δ T細(xì)胞對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW-1990的殺傷活性。結(jié)論GABA能顯著抑制γ δ T細(xì)胞的增殖,抑制γ δ T細(xì)胞的殺傷活性。提示GABA可能是通過(guò)影響細(xì)胞周期及凋亡對(duì)γ δ T細(xì)胞發(fā)揮作用,進(jìn)而影響其殺傷活性。

γ-氨基丁酸;γ δ T 細(xì)胞;凋亡;殺傷活性

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),它不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,而且廣泛存在于外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織細(xì)胞中[1]。有研究發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)的許多淋巴細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)活性分子的受體,調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用。最近研究證實(shí),CD4+和(或)CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)GABAA受體,GABA與其A受體結(jié)合能夠抑制抗原特異性T細(xì)胞活化,具有免疫抑制作用[2]。然而,對(duì)于 T細(xì)胞的另一亞群γ δ T細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)之間的相互作用的研究較少。γ δ T細(xì)胞是固有免疫的一個(gè)重要細(xì)胞群,它廣泛分布于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)上皮組織內(nèi),末梢血中也有一定的數(shù)量。自從1990年Zocchi等[3]首次從2例肺癌患者的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)中分離出γ δ T細(xì)胞,并觀察到對(duì)自體腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷性之后,又有文獻(xiàn)報(bào)道γ δ T細(xì)胞對(duì)許多腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GABA作用于人γ δ T細(xì)胞,研究其對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和對(duì) SW-1990人胰腺癌細(xì)胞的殺傷活性的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640干粉為Gibco公司產(chǎn)品,人AB型血清購(gòu)自徐州市血站,胎牛血清和淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院血液學(xué)研究所,Hepes(Amersham公司產(chǎn)品)購(gòu)于天來(lái)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司,異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、GABA、四甲基偶氮唑藍(lán)(MT T)、二亞甲砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma公司,IL-2購(gòu)于廈門(mén)特寶生物工程股份有限公司,SW-1990人胰腺癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。流式細(xì)胞分析儀(TACS Calibur)為美國(guó) BECTON DICKINSON公司產(chǎn)品,恒溫CO2培養(yǎng)箱(Heraeuas公司)、倒置顯微鏡為德國(guó)Wilovert公司產(chǎn)品,SEAC全自動(dòng)酶免系列分析儀和配套的LDH試劑盒為北京希亞克技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 γ δ T細(xì)胞的培養(yǎng)及收集 取健康獻(xiàn)血者末梢抗凝血10 mL,加入淋巴細(xì)胞分離液,以 2 000 r/min離心15 min,吸取單個(gè)核細(xì)胞層,用生理鹽水洗滌3遍(1 500 r/min離心,每次10 min),加入 RPMI1640培養(yǎng)液中(含10%小牛血清、5%人AB血清),IPP 3 ng/mL和 IL-2 100 IU/mL,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×108/L,置75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)添加培養(yǎng)液。取細(xì)胞培養(yǎng)瓶以1 500 r/min離心5～ 6 min,棄上清液,收集培養(yǎng)的 γ δ T細(xì)胞加入新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液配成所需濃度的細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 SW-1990胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 將人SW-1990胰腺癌細(xì)胞株置含10%的小牛血清RPM I-1640培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,每2～3天傳代1次。

1.2.3 M TT法檢測(cè) GABA和 PTX對(duì)γ δ T細(xì)胞增值的影響實(shí)驗(yàn)分為不同濃度的GABA組和對(duì)照組。GABA的濃度為10、100、200、400、800、1 600、3 200 μ mol/L;對(duì)照組用等體積的RPM I-1640代替,取剛收集的 γ δ T 細(xì)胞配成1×105/mL,分別接種于96孔板中,每孔0.2 mL,加入不同濃度的GABA,每組設(shè)3個(gè)復(fù)空,于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天半量換培養(yǎng)基及加入相對(duì)等的藥物,繼續(xù)孵育10 d后每孔加入MTT液20 μ L,37℃孵育 4 h后棄上清液,每孔加入 DMSO 150 μ L,輕輕振蕩10 min使甲瓚充分溶解,在 540 nm 波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值,求其平均值;同時(shí)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期影響的檢測(cè) 收集γ δ T細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min,70%冷乙醇固定,離心后加入PI染液1 mL(生理鹽水 129.6 mL,PI 100μ g,RNA酶 2 mg,Triton-X-100 1 mL,枸櫞酸鈉 200 mg,加雙蒸水至200 mL)4℃避光染色30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè),每個(gè)樣本分析10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.5 LDH 法檢測(cè)GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞殺傷SW-1990胰腺癌細(xì)胞活性的影響 將SW-1990胰腺癌細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期,收集細(xì)胞用 Hank′s液洗2次,配成2×105/mL;效應(yīng)細(xì)胞(γ δ T)配成 2×106/mL,將效、靶細(xì)胞數(shù)按10∶1比例混合。無(wú)菌塑料管3支各加入胰腺癌細(xì)胞懸液0.5 mL。測(cè)定管加入經(jīng)GABA作用的γ δ T細(xì)胞懸液0.5 mL。對(duì)照組用未經(jīng)GABA作用的γ δ T細(xì)胞,設(shè)靶細(xì)胞自然釋放管(SW-1990細(xì)胞加0.5%BSA-RPMI-1640 0.5 mL)及最大釋放管(SW-1990細(xì)胞加 1%NP400.5 mL),每組設(shè) 4管。以 500 r/min離心 5 min,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 5 h后,輕輕混勻細(xì)胞,再以1 500 r/min離心 10 min。收集上清液,用 Encore全自動(dòng)生化分析儀,測(cè)定 LDH 的活性單位(u/L)。γ δ T細(xì)胞殺傷活性=(測(cè)定管 LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放 LDH單位)/(最大釋放管LDH單位-靶細(xì)胞自然釋放管LDH單位)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)值以±s表示,采用兩組均數(shù)t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞增殖的影響 GABA能顯著地抑制γ δ T細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.01),呈劑量依賴性,見(jiàn)表 1。

表1 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(n=3)

2.2 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期影響的檢測(cè) GABA能顯著促進(jìn)γ δ T細(xì)胞的凋亡,細(xì)胞凋亡比例從 14.84%到35.46%。隨著藥物濃度的增高,G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,G2/M、S期細(xì)胞比例逐漸下降,呈劑量依賴性(P＜0.05),見(jiàn)表2。

2.3 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞殺傷活性的影響 GABA可以抑制γ δ T細(xì)胞對(duì)SW-1990胰腺癌細(xì)胞株的殺傷活性,呈濃度依賴性(P＜0.01),見(jiàn)圖 1。

表2 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞周期及凋亡的影響(±s,%,n=3)

表2 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞周期及凋亡的影響(±s,%,n=3)

與對(duì)照組及各濃度組之間比較,#:P＜0.01。

組別 G0/G1 G2/M S 凋亡率對(duì)照組(GABA 0 μ mol/L) 38.87±1.38 13.45±0.89 47.67±2.26 14.62±0.60 GABA 200μ M 組 39.43±3.40 10.94±2.45# 49.28±3.77# 14.32±0.34 GABA 800μ M 組 34.75±3.51# 9.63±0.49# 55.62±3.91# 28.99±1.20#GABA 3 200μ M 組 30.04±1.17# 7.30±0.85# 62.65±0.97# 35.39±0.90#

圖 1 GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞殺傷活性的影響

3 討 論

在人類外周淋巴器官及血液中的多數(shù) T細(xì)胞屬于α βT細(xì)胞,這些α β T細(xì)胞來(lái)源于骨髓的多能造血干細(xì)胞,并且在胸腺中分化為CD4+和(或)D8+T細(xì)胞,隨后定居于外周淋巴器官發(fā)揮其生物學(xué)作用。1984年Saito及其研究小組首次發(fā)現(xiàn)在正常外周血淋巴細(xì)胞中除了占絕大多數(shù)的α βT細(xì)胞群之外,還有一群為數(shù)只占不到T細(xì)胞總數(shù)5%的、由γ和δ鏈基因編碼T 細(xì)胞受體(TCRs)的T 細(xì)胞,即γ δ T 細(xì)胞。 與α β T 細(xì)胞不同,γ δ T細(xì)胞主要分布于皮膚、肺、腸、生殖泌尿道等器官。多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),γ δ T細(xì)胞在抗炎癥、抗病原體、抗腫瘤等方面發(fā)揮了巨大的作用[6]。國(guó)內(nèi)以往在體外培養(yǎng)擴(kuò)增γ δ Σ細(xì)胞通常用γ δ TCR單克隆抗體固相包被、結(jié)核桿菌低分子多肽抗原誘導(dǎo)、HSP70多肽誘導(dǎo)和磷酸脂配體誘導(dǎo)等方法[7]。作者應(yīng)用IPP和IL-2共刺激法在體外培養(yǎng)10 d時(shí)γ δ T細(xì)胞的比率從培養(yǎng)前4.21%升至 70.35%,γ δ T細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)100倍。此足量的高純度的γ δ Σ細(xì)胞基本上滿足了目前研究和臨床應(yīng)用的需要[8]。

自20世紀(jì)90年代以來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)顯示神經(jīng)遞質(zhì)受體在非神經(jīng)組織的表達(dá),就免疫系統(tǒng)而論,盡管巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)也表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)受體,但是研究者的興趣大多集中在胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞上。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)受體如苯二氮 類受體、乙酰膽堿受體、谷氨酸受體、GABA受體、甘氨酸受體等在CD4+和(或)CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)均有報(bào)道,其受體激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)T細(xì)胞的分化、成熟及其分泌細(xì)胞因子(如 IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TGF-α)等方面均有不可忽視的影響[9],但是關(guān)于γ δ T細(xì)胞與神經(jīng)遞質(zhì)的相互作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。

GABA主要有 A、B、C 3種受體亞型,A和C受體是配體門(mén)控離子通道超家族(ligand-gated ion channel superfamily)成員,A受體是異聚體Cl-離子通道,可被生物堿、Picrotoxin等阻斷。B受體是七跨膜偶聯(lián)G蛋白受體家族,可激活第2信使系統(tǒng)及Ca2+和K+通道。Sabina等[2]最近研究發(fā)現(xiàn)人類外周血T細(xì)胞上表達(dá)GABA受體,并且可以對(duì)T細(xì)胞發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)用GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞的影響研究表明,GABA可抑制γ δ T細(xì)胞的生長(zhǎng),并且在第1天加入GABA 時(shí)有作用,當(dāng)培養(yǎng)7 d加入時(shí)卻無(wú)此作用。此結(jié)果表明GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞增殖的抑制作用是在IPP激活前發(fā)生的,對(duì) IPP激活后的γ δ T細(xì)胞無(wú)明顯作用。

與Tian等[10]報(bào)道結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn) GABA 對(duì)γ δ T細(xì)胞的細(xì)胞周期也有一定的影響。不同濃度GABA作用后,G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升,G2/M期、S期細(xì)胞比例降低,結(jié)果提示GABA能夠抑制γ δ T細(xì)胞生長(zhǎng),影響細(xì)胞周期進(jìn)程,使γ δ T 細(xì)胞停滯在G0/G1期,并且顯著地促進(jìn) 了 γ δ T 細(xì)胞凋亡 。因此,GABA是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,影響細(xì)胞周期發(fā)揮作用的,但不排除通過(guò)A、B、C受體或其他途徑實(shí)現(xiàn),其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面反映了γ δ T與α βT細(xì)胞之間的相似之處。

γ δ-TCR 和 NKG2D 是 γ δ T 細(xì)胞上表 達(dá)的主 要與炎 癥 、腫瘤等免疫相關(guān)的兩類主要的受體,其殺傷活性與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體如MICA/MICB、ULBP1-4等密切相關(guān)[11]。對(duì)殺傷活性的研究發(fā)現(xiàn),GABA可以抑制γ δ T細(xì)胞對(duì) SW-1990胰腺癌細(xì)胞株的殺傷,并呈劑量依賴性。此結(jié)果表明,γ δ T細(xì)胞的殺傷活性可能主要是通過(guò)γ δ-TCR介導(dǎo)的,是否也通過(guò) NKG2D等其他途徑目前尚不清楚。至于GABA通過(guò)何種途徑影響γ δ T細(xì)胞表面受體的表達(dá)、如何對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用尚須深入的研究。

上述實(shí)驗(yàn)資料表明,GABA對(duì)γ δ T細(xì)胞的影響可能與多種途徑有關(guān),深入認(rèn)識(shí)其作用和作用機(jī)制,對(duì)于解釋?duì)?δ T細(xì)胞的功能及其與神經(jīng)遞質(zhì)間的相互作用具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值,而且對(duì)于闡明γ δ T細(xì)胞對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷活性的臨床作用基礎(chǔ)也具有重要的參考價(jià)值。另外還可以為神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)之間相互作用提供證據(jù)。

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Effects of γ-aminobutyric acid on human peripheral blood γ δ T cells in vitro

HE Xiao-hua,LIU Shi-yu

(Department of Gastroenterology,the First People′s Hospital of Xuzhou,Xuzhou,J iangsu221000,China)

ObjectiveTo research the effects of GABA on proliferation,cell cycle,apoptosis,cytotoxicity and possible mechanism of action of human peripheral blood γ δ T cells.MethodsUsed the isopentenyl pyrophosphate(IPP)method to amplify human peripheral blood γ δ T cells in vitro.After different doses of GABA to treat with γ δ T cells,M TT method was used to detect the proliferation of γ δ T cells;And then investigated the cell cycle and apoptosis of γ δ T cells by flow cytometry;Meanwhile,measured to cytotoxicity of γ δ T cells by lactate dehydrogenase method.ResultsGABA could decrease the proliferation of γ δ T cells in a dosedependent manner(P＜0.01).The cell cycle of γ δ T cells was greatly affected by treated with GABA,and the apoptosis was increased.GABA could restraintγ δ T cells killing the SW-1990 cell line.ConclusionGABA may effect on γ δ T cells through cell cycle and apoptosis,and then affect the cytotoxicity of γ δ T cells.

γ-aminobutyric acid;γ δ T cells;apoptosis;cytotoxicity

R741.02;R338

A

1671-8348(2010)07-0804-03

2009-08-17

2009-09-28)

?論 著?