印國兵,孫治君,郭 丹,楊 露,林子晶,范勝浩

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科 400010)

自從20世紀70年代發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)有抗腫瘤作用以來,惡性腫瘤細胞是否對其耐藥一直存在廣泛爭議,為此,本文對乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADR細胞及其親本MCF-7細胞對As2O3的耐藥狀況進行了研究,并對相關機制作了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 MCF-7/ADR細胞購自中山醫(yī)科大學腫瘤研究所,MCF-7細胞由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科實驗室饋贈。RMPI1640培養(yǎng)液由干粉按說明書配制而成,加10%胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)。亞砷酸注射液(含 As2O31 mg/mL,每支10 mg)以生理鹽水配成200μmol/L儲備液,存放于-80℃,臨用時以培養(yǎng)液稀釋到相應濃度。臨用前1 d將MTT干粉以生理鹽水配成5 mg/mL。Pgp、MRP1免疫組化試劑盒購自武漢博士得公司;GST試劑盒購自南京建成公司。

1.2 研究方法

1.2.1 MTT實驗 將細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下,MCF-7/ADR細胞培養(yǎng)液中加入5μmol/L的阿霉素維持培養(yǎng),實驗前1周停藥。MCF-7/ADR和MCF-7細胞均按 As2O30.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、16.0 μmol/L 分為 7 個實驗組,設陰性對照和空白對照。將對數(shù)生長期的上述兩種細胞按103/mL分別接種于5塊96孔培養(yǎng)板,每孔200μL,每組設4個復孔,重復3遍。待細胞貼壁后,更換含有相應濃度As2O3的培養(yǎng)液,但陰性對照不加As2O3,空白對照只加培養(yǎng)液。加藥后每24 h各取出一塊培養(yǎng)板,分別加入20μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入150μL DMSO振蕩溶解10 min,用空白對照調(diào)零,在酶聯(lián)儀490 nm波長下檢測各孔的吸光值。生長抑制率=(陰性對照組OD值-藥物組OD值)/陰性對照組OD值×100%。

1.2.2 Pgp、MRP1表達的測定及結(jié)果判斷 MCF-7和 MCF-7/ADR細胞設空白組、0.5μmol/L組、2.0μmol/L組,每組20個標本。細胞直接培養(yǎng)于6孔板內(nèi)的蓋玻片上,細胞進入對數(shù)生長期后,空白組不加藥,藥物組加入相應濃度As2O3繼續(xù)培養(yǎng)48 h,取出蓋玻片,PBS液洗片,丙酮固定,依照SABC免疫組化試劑盒說明書進行染色。根據(jù)每張載玻片上至少10個視野(大于200個細胞)中陽性細胞數(shù)的比例計算表達率。另參照Simler等的方法進行染色強度分級,(-):胞膜及胞漿內(nèi)無明顯染色,放大倍數(shù)為10×40時仍難辨認;(+):淺著色,胞膜及胞漿內(nèi)部分為淺棕色,放大倍數(shù)為10×40時可以辨認,但著色弱,放大倍數(shù)為10×10時難辨認;(++):中度著色,胞膜及胞漿內(nèi)均為淺棕色,放大倍數(shù)為10×10時能辨認;(+++):強著色,胞膜及胞漿內(nèi)深著色,放大倍數(shù)為10×10時能清楚辨認。

表1 兩種細胞用藥前后Pgp、MRP1的陽性表達率±s,%)

表1 兩種細胞用藥前后Pgp、MRP1的陽性表達率±s,%)

空白組0.5μmol/L組2.0μmol/L組癌株P Pgp MRP1Pgp MRP1Pgp MRP1 MCF-7 45.82±5.91 35.99±4.10 47.51±6.12 38.19±4.62 48.80±6.90 37.14±5.82 ＞0.05 MCF-7/ADR 66.67±6.99 46.54±4.79 72.15±6.93 61.11±5.03 85.87±7.72 64.72±5.64 ＜0.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

1.2.3 GST活性的測定 MCF-7和MCF-7/ADR細胞均取空白組、0.5μmol/L組、2.0μmol/L組進行測定,每組15個標本。細胞培養(yǎng)于100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi),細胞進入對數(shù)生長期后,空白組不加藥,藥物組加入相應濃度As2O3繼續(xù)培養(yǎng)48 h,胰酶消化收獲細胞,調(diào)整每個標本內(nèi)細胞數(shù)至107,加入勻漿介質(zhì)(0.86%生理鹽水),冰浴條件下在勻漿管中充分研磨,制成細胞勻漿,用Lowry法測定蛋白含量,然后調(diào)整蛋白含量至約5 mg/mL后進行GST酶活性的測定。操作過程按照GST試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 結(jié)果用SAS8.1統(tǒng)計軟件進行分析,MTT試驗和GST測定結(jié)果采用方差分析,Pgp、M RP1表達情況采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3對MCF-7/ADR和MCF-7細胞的不良反應 不同劑量As2O3對MCF-7/ADR和MCF-7細胞的抑制率隨時間的變化分別見圖1、2?？梢?0.5～1.0μmol/L的 As2O3對MCF-7/ADR和MCF-7細胞抑制作用都較弱,而2.0～16.0 μmol/L的As2O3對兩種細胞均有抑制作用,并呈時間劑量依賴關系;其 96 h的 IC50分別為 12.8μmol/L和3.0μmol/L。單因素重復測定的方差分析顯示作用時間和作用濃度對兩種細胞都有正向的交互作用,在相同條件下,As2O3對MCF-7/ADR和MCF-7細胞抑制率的兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),前者的抑制率明顯低于后者。

圖1 As2O 3對MCF-7/ADR細胞的生長抑制作用

2.2 Pgp、M RP1免疫組化測定結(jié)果 見表1。采用χ2檢驗,MCF-7細胞用藥前后各組間Pgp、MRP1的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而MCF-7/ADR細胞用藥前后各組間Pgp、MRP1的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),相同組別下MCF-7/ADR細胞Pgp、MRP1的表達率均顯著強于MCF-7細胞(P＜0.05),且表達強度也強于 MCF-7細胞(圖3、4)。

圖2 As2O3對MCF-7細胞的生長抑制作用

圖 3 用藥前后 Pgp的表達情況(SABC 10×40)

圖4 用藥前后MRP1的表達情況(SABC 10×40)

2.3 用藥前后GST活性 見表2。未用藥前MCF-7/ADR細胞GST活性高于MCF-7細胞,用藥后MCF-7/ADR細胞GST活性進一步增高,而MCR-7細胞未出現(xiàn)此情況。

表2 兩種細胞用藥前后GST活性測定結(jié)果(u/mg±s)

表2 兩種細胞用藥前后GST活性測定結(jié)果(u/mg±s)

方差分析顯示,a與d、b與e、c與f比較,P ＜0.05;d與e、d與f比較,P＜0.05;而a與b、a與c比較,P＞0.05。

癌株 空白組 0.5μmol/L組2.0μmol/L組 P MCF-7 4.80±1.13a 5.29±1.22b 5.62±1.48c ＞0.05 MCF-7/ADR 9.36±1.90d 16.94±2.73e 19.25±2.84f ＜0.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

已有一些研究表明,As2O3對多種惡性腫瘤有治療作用[1],也有報道認為As2O3可部分逆轉(zhuǎn)入乳腺癌MCF-7/ADM細胞對ADM的耐藥性,其逆轉(zhuǎn)機制可能與細胞內(nèi)GST-π的改變有關[2]。但乳腺癌尤其其耐藥株對As2O3耐藥與否至今仍然是相關研究領域的一個空白。本研究發(fā)現(xiàn),0.5～16.0μmol/L的As2O3對MCF-7細胞均有生長抑制作用,其中,0.5～1.0μmol/L的As2O3抑制作用較弱,2.0～16.0 μmol/L的As2O3則顯示明顯的生長抑制作用,并隨作用時間和作用濃度的增加而增強?？梢?As2O3對MCF-7細胞有良好的增殖抑制作用,與文獻報道一致。As2O3也能抑制MCF-7/ADR細胞的增殖,但細胞毒實驗表明:(1)相同濃度As2O3對MCF-7/ADR細胞的抑制率明顯低于其親代MCF-7細胞,2.0μmol/L的 As2O3作用120 h兩者的抑制率分別為 18.6%和40.1%;(2)MCF-7/ADR細胞96 h的IC50值高達12.8 μmol/L,顯著高于其親代 MCF-7細胞的3.0μmol/L;(3)8 μmol/L As2O3達到50%的抑制率,MCF-7/ADR細胞需要115.2 h,而 MCF-7細胞僅需 72.6 h,表明 As2O3對MCF-7/ADR細胞的起效時間晚于MCF-7細胞。可見,MCF-7/ADR細胞較其親代MCF-7細胞對As2O3有耐藥表現(xiàn),耐藥倍數(shù)為4.27倍。

耐藥性是影響腫瘤患者化療效果的重要因素,其中多藥耐藥是化療失敗的主要原因之一,多藥耐藥表型與許多因素有關,其中,Pgp、MRP1、GST過度表達是多藥耐藥的重要發(fā)病機制。隨著近年來對As2O3耐藥問題研究的深入,越來越多的研究結(jié)果表明高表達Pgp、MRP1和GST/GSH解毒酶系統(tǒng)的癌細胞可對As2O3產(chǎn)生有效的耐受。Vernhet等[3-4]以肺癌GLC4細胞和MRP1高表達的GLC4/Sb30細胞為研究對象,發(fā)現(xiàn)后者對亞砷酸鹽、砷酸鹽的耐藥倍數(shù)分別是其母細胞(GLC4細胞)的12.7、16.3倍,同時,該細胞 MRP1的表達明顯增加。Yang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)對 As2O3敏感的膀胱癌、APL、胃癌細胞內(nèi)谷胱甘肽濃度明顯低于其他癌細胞,而對砷交叉耐藥的多藥耐藥癌細胞較其敏感的親代細胞往往含有較高的GSH水平。Liu等[6]則認為長期砷暴露的細胞通過過表達Pgp、MRP1/MRP2以及GST-Pi對砷產(chǎn)生獲得性耐藥。本實驗中,用藥前MCF-7細胞 Pgp、M RP1和GST的表達較MCF-7/ADR細胞弱,施加 As2O348 h后Pgp、MRP1和GST的表達增強也不明顯;而MCF-7/ADR未用藥前3者的表達均已較強,給藥后更出現(xiàn)了 Pgp、MRP1的過表達以及GST活性的顯著增加。推測這種差異正是造成MCF-7/ADR對As2O3耐藥的原因,但何者在此過程中起了主導作用尚待進一步研究。

[1] 印國兵,吳誠義.砷劑對乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR細胞生長抑制作用的比較研究[J].重慶醫(yī)科大學學報,2005,30:570.

[2] 王婷,雙躍榮.三氧化二砷逆轉(zhuǎn)入乳腺癌MCF-7/ADM細胞耐藥的機制研究[J].中華腫瘤雜志,2002,24:339.

[3] Vernhet L,Allain N,Payen L,et al.Resistance of human multidrug resistance-associated protein 1 overexpressing lung tumor cells to the anticancer drug arsenic trioxide[J].Biocheical Pharmacology,2001,61(7):1387.

[4] Vernhet L,Seite MP,Allain N,et al.Arsenic induces expression of the multidrug resistance-associated protein 2(MRP2)genein primary rat and human hepatocytes[J].J Pharmacol Exp Ther,2001,298(1):234.

[5] Yang CH,Kuo ML,Chen JC,et al.Arsenic trioxide sensitivity is associated with low level of glutathione in cancer cells[J].Br JCancer,1999,81(5):796.

[6] Liu J,Chen H,Miller DS,et al.Overexpression of glutathione S-transferase II and multidrug resistance transport proteins is associated with acquired tolerance to inorganic arsenic[J].Mol Pharmacol,2001,60(2):302.