林 爽,李 力,易 萍,鄭秀惠,郭建新,韓 健

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所婦產科,重慶 400042)

宮頸癌中Eag1鉀離子通道的表達以及缺氧對其的調控作用*

林 爽,李 力△,易 萍,鄭秀惠,郭建新,韓 健

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所婦產科,重慶 400042)

目的研究不同病變宮頸組織中Eag1表達情況以及缺氧對宮頸癌Hela細胞膜上Eag1鉀離子通道表達的影響。方法采用免疫組化、免疫熒光和RT-PCR法,檢測不同病變宮頸組織和宮頸癌Hela細胞中Eag1蛋白的表達情況,以及不同缺氧時間和缺氧濃度對Hela細胞中Eag1 mRNA表達的影響。結果免疫組化結果表明,宮頸上皮內瘤變組織中Eag1蛋白的表達明顯高于正常組,宮頸癌組織中Eag1的表達明顯高于宮頸上皮內瘤變組;Eag1的表達隨臨床分期的增高而增加;與病理分級無明顯相關性。免疫熒光、RT-PCR結果表明,正常培養(yǎng)的宮頸癌Hela細胞中即有Eag1表達;其表達隨缺氧程度加深及缺氧時間的延長明顯增強。結論Eag1鉀離子通道蛋白有可能成為新的早期篩查和判斷宮頸癌生物學行為的診斷指標。Eag1在宮頸癌Hela細胞缺氧感受中起重要的作用。

宮頸癌;鉀離子通道;Eag1

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤,雖然目前診療技術有了較大的提高,但仍有30%～40%的患者死于局部復發(fā)和遠處轉移。最近有關離子通道與低氧適應之間的關系引起了越來越多的注意[1]。有研究認為膜Eag1鉀離子通道宮頸癌的相關性最為密切[2]。但目前Eag1在宮頸癌組織中的表達情況仍需進一步證實。本研究以不同病變宮頸組織和體外培養(yǎng)的人宮頸癌Hela細胞為研究對象,通過研究Eag1鉀離子通道在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的表達情況以及缺氧對Eag1鉀離子通道表達的影響,以期為宮頸癌的診治提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本全部來自本院婦產科1995年12月至2008年12月診治的病例,全部標本均經本院病理科診斷并證實。選取慢性宮頸炎20例,宮頸上皮內瘤變(CIN)40例(CINⅠ15例,CINⅡ10例,CINⅢ15例),宮頸鱗癌80例,共計140例?；颊吣挲g24～77歲,平均 46歲。

1.2 細胞缺氧模型的準備 觀察細胞70%～90%融合,細胞貼壁形態(tài)良好。在無菌條件下棄去大部分培養(yǎng)液,剩余培養(yǎng)基僅可將細胞覆蓋,以減少氣體彌散距離。將各組細胞同時置于密閉容器,將混合氣體(含 90%N2、5%CO2、5%O2)以 10 L/min流量充入密閉容器,持續(xù)20 min,同時關閉進氣口和出氣口,抽取氣體經血氣分析儀檢測容器內O2濃度小于5%。

1.3 Eag1表達的檢測

1.3.1 免疫組化檢測方法 兔抗人Eag1單克隆抗體購自sigma公司。組織標本常規(guī)石蠟包埋,制成4 μ m厚切片,常規(guī)脫蠟,30%新鮮雙氧水滅活內源酶,將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),微波爐加熱至沸后斷電,間隔10 min重復2次,冷卻后0.02 M PBS洗滌,抗原修復液修復抗原,山羊血清封閉后不洗,滴加1∶150稀釋的Eag1單克隆抗體,4℃過夜,0.02 M PBS洗后加生物素標記羊抗兔二抗,30℃染色20 min后,DAB顯色,蘇木素輕度復染,二甲苯透明,封片。顯微鏡下觀察并計數陽性染色細胞數。

1.3.2 免疫熒光檢測方法 對數生長期的Hela細胞接種于裝有載玻片的無菌培養(yǎng)皿中,95%乙醇室溫固定30 min。加0.3%TritonX-100室溫 10 min;PBS洗3次,每次10 min;正常山羊血清37℃封閉10 min,吸去不洗;加兔抗人單克隆抗體Eag1(1∶100),4℃孵育;PBS洗3次,每次10 min;加羊抗兔IgG-FITC(1∶100),37℃孵育2 h;PBS洗 3次,每次10 min;熒光顯微鏡觀察照相。

1.3.3 判斷標準 Eag1主要定位于胞漿和(或)胞膜。根據腫瘤細胞顯色的比例及染色強度,對Eag1表達作半定量評定[3]。按陽性細胞率評分:陽性細胞數小于 11%為 1分;11%～50%為2分;51%～80%為3分;大于 80%為4分。按顯色程度評分:染色弱為1分;中等染色為2分;強染色為3分。然后將2種評分結合起來分為4級:無論染色強度如何,細胞陽性率小于或等于10%為陰性;評2～3分者為弱陽性(+);評4～5分者為中度陽性(++);6～7分者為強陽性(+++)。若1例標本有2個染色結果,則取1個納入統(tǒng)計。

1.4 RT-PCR法檢測Eag1 mRNA表達 Trizon試劑盒購自Invitrogen公司,反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。Eag1引物為 :5′-TAA TGG CT T CCC TCT T TC ATC TCC T-3′;5′-TGT TGA GAC TCC TCC ATT CCT TCC A-3′(450 bp);βactin 引物為 :5′-CAC GGC TGC TTC CAG CTC CT-3′;5′-CTC CTG CT T GCT GAT CCA CAT C-3′(150 bp)。 取(0.5～1)×107細胞,按 Tripil試劑盒說明提取總 RNA,按反轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應,Eag1 mRNA的PCR反應條件為94℃變性30 s,58℃Eag1退火30 s,72℃2 min,最后72℃延伸2 min。瓊脂糖電泳測定Eag1 mRNA表達,拍照。每一組檢測6瓶細胞。

2 結 果

2.1 Eag1蛋白在不同宮頸病變中的表達

2.1.1 Eag1在慢性宮頸炎、CIN及宮頸鱗癌中的表達 Eag1在3種組織中均為細胞漿、胞膜表達,細胞核未見表達。Eag1在慢性宮頸炎及CIN中呈輕度著色,Eag1在宮頸鱗癌中呈中強度著色,陽性信號彌漫分布于癌巢內(插頁Ⅰ圖 1～3)。Eag1在宮頸鱗癌中的表達率明顯高于慢性宮頸炎組和CIN組,CIN組內Eag1表達率明顯高于慢性宮頸炎組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),結果見表1。

2.1.2 Eag1在各級CIN中的表達 Eag1在C1N各級之中的表達隨病變程度的增高逐漸增高,但各組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 2。

表1 Eag1在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌組織中的表達

2.1.3 Eag1表達與宮頸癌臨床病理學指標的關系 Eag1在不同病理分級中的陽性表達率雖然隨病變惡性程度的增高逐漸增高,但各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在不同的臨床期中,Ⅰ+Ⅱ期組 Eag1表達明顯高于0期(P＜0.01),而Ⅲ+Ⅳ期組Eag1表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期組和0期組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),結果見表3。

表2 Eag1在各級CIN中的表達

表3 Eag1表達與宮頸癌臨床分期、病理分級的關系

圖5 不同缺氧條件下宮頸癌Hela細胞中Eag1 mRNA水平變化

2.2 Eag1蛋白在Hela細胞的表達 本科選擇宮頸癌Hela細胞株,采用間接免疫熒光法檢測細胞內Eag1蛋白的表達,結果發(fā)現Eag1蛋白主要集中在細胞膜上及胞漿中(插頁Ⅰ圖4)。

2.3 缺氧對Eag1 mRNA表達的影響 采用RT-PCR法檢測了Eag1 mRNA在不同缺氧條件下宮頸癌Hela細胞系的表達情況,給予不同缺氧條件,3 h后Hela細胞中其mRNA的表達水平不盡相同,隨缺氧程度的增加呈現先增高后降低的趨勢(圖5);在5%氧濃度條件下,其表達隨缺氧時間的增加逐漸增高,見圖 6。

圖6 不同缺氧時間下宮頸癌Hela細胞中Eag1 mRNA水平變化

3 討 論

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一。研究發(fā)現腫瘤內部乏氧不僅可引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,還可引起腫瘤細胞放化療抵抗,但其具體的缺氧調控機制仍不十分清楚。最近有關離子通道與低氧適應之間的關系引起了越來越多的注意[3-4]。離子通道中最常與細胞增殖和腫瘤相關的是鉀通道;其中膜Eag1鉀離子通道被認為與宮頸癌的相關性最為密切。

Eag1鉀離子通道是1969年發(fā)現的一種新的通道,屬電壓門控性鉀通道,通過去極化而激活。專一分布于大腦,在肌細胞和胎盤中有少量表達[5-6]。Eag表達和激活在多種腫瘤細胞株和重要的腫瘤組織中被證實。Fatias等[7]通過對6例宮頸癌組織標本和12例正常宮頸組織進行逆轉錄PCR和Southern印跡實驗,發(fā)現6例宮頸癌標本Eag1表達全部為陽性,而正常對照標本的陽性率僅為33%。作者認為Eag1表達的升高可能是腫瘤發(fā)生的早期信號,Eag1鉀離子通道不僅可以作為腫瘤標志物、疾病早期標志,也將成為潛在的宮頸癌治療靶點。Faris等[8]的研究也有相似發(fā)現,認為 Eag1鉀離子通道的表達與否及其通道活性大小對癌細胞的增殖非常重要,認為其可能成為潛在的宮頸癌細胞膜上的治療靶點,但是上述研究均未從Eag1的表達情況與宮頸癌臨床分期、病理組織類型等方面進行分析,因此,Eag1與宮頸癌之間的相關性仍需進一步研究。

本研究在應用FIGO分期的基礎上,采用免疫組化法檢測不同宮頸組織中Eag1蛋白的表達,結果顯示,在CIN組織中Eag1的表達明顯高于慢性宮頸炎組,而宮頸癌組織中Eag1的表達又明顯高于CIN組,Eag1表達隨臨床分期升高顯著增高,說明在宮頸癌的生長過程中,Eag1鉀離子通道與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。并且隨著腫瘤向深層生長,Eag1表達水平更高,推測腫瘤生長過速,缺氧加重,激活更多的基因表達,更能增加它在胞內的水平。本實驗結果顯示,Eag1的表達水平隨病理分級的升高而升高,但各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。分析其原因,考慮為不同病理分級的腫瘤組織中均有不同程度的低氧區(qū)域所致。本研究的間接免疫熒光結果也顯示,在正常培養(yǎng)的Hela細胞內可以檢測到明顯的綠色熒光,證明其中有Eag1蛋白表達。

隨著對Eag1結構和功能的深入研究,發(fā)現Eag1通道形成的四聚體中,每一個單體有6個假定的主要包含電壓傳感蛋白的跨膜區(qū)(富含正電荷氨基酸)[9],并且它的細胞內側端有一個PAS區(qū)即為氧感受器,它可根據氧分壓PO2的變化調節(jié)自身電導系數,推測其與腫瘤乏氧有關[10]。

采用RT-PCR法檢測不同氧濃度下 Hela細胞內Eag1 mRNA水平情況,結果顯示隨氧濃度的降低,Eag1 mRNA水平呈先升高后降低的趨勢,輕度缺氧條件下,缺氧作用0.5 h時細胞內Eag1 mRNA水平即開始升高,3 h后達高峰,6 h后盡管有所減弱,但仍強于常氧條件下,提示隨缺氧程度加深及時間的延長,Eag1 mRNA水平明顯增強。

[1] Camacho J,Saá nchez A,Pardo LA,et al.Cytoskeletal interactions determine the electrophysiological properties of human EAG potassium channels[J].Pflugers Arch,2000,441(2):167.

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Expression of Eag1 K+channel in cancer of the cervix and the regulation of hypoxia*

LIN Shuang,LI Li△,Y I Ping,et al.

(Department of Obstreics and Gynecology,Daping Hospital,the Third Military University,Chongqing400042,China)

ObjectiveImmunohistochemistry was employed to detect the expression of Eag1 protein in different cervix uteri tissues and CACX Hela cells.MethodsWe determined the effects of different hypoxia time and hypoxic concentration on the expression of Eag1 mRNA in Hela cell by using RT-PCR.ResultsThe expression of Eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia(CIN)tissue was significantly higher than that in normal control group,and the expression in CACX tissue was remarkably higher than that in CIN group.The expression of Eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer,but almost irrelevant to pathological grade.Resultsof immunofluorescence and RT-PCR suggested that the expression of Eag1 significantly increased along with the aggravation of hypoxic degree and prolong of hypoxia time.ConclusionEag1 K+channel protein is possible to become diadynamic criteria for new early screening and CACX biological behavioral judgment.Meanwhile,Eag1 plays an important role in hypoxic reception of CACX Hela cell.

cervical cancer;potassium channels;Ether à-go-go

R737.33;R730.43

A

1671-8348(2010)08-0899-03

國家衛(wèi)生部課題資助項目(WKJ2007-3-001)?！?/p>

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2009-08-14

2009-09-08)