丁 芳,李志英,周紅林,楊世華

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北宜昌443001;2.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科,昆明650101;3.中科院昆明動物所,昆明650223)

小鼠早期胚胎幾種不同培養(yǎng)方法的比較

丁 芳1,李志英1,周紅林2△,楊世華3

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖北宜昌443001;2.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦科,昆明650101;3.中科院昆明動物所,昆明650223)

目的 探討小鼠胚胎體外發(fā)育中的最佳培養(yǎng)方案。方法 將從超排的 ICR雌鼠輸卵管內(nèi)收集的1-細(xì)胞放入無糖CZB中培養(yǎng),分別于2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑椹胚階段更換入含3.0 mmol/L葡萄糖(最適濃度)的CZB中,以及胚胎培養(yǎng)全程均在含糖CZB中更換1次培養(yǎng)液、胚胎培養(yǎng)全程均在含糖CZB中不更換培養(yǎng)液,對照組胚胎培養(yǎng)全程均在無糖CZB中,觀察記錄胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果 2-細(xì)胞、4-細(xì)胞階段換入含糖CZB中的序貫培養(yǎng)及培養(yǎng)全程在含糖CZB中單一培養(yǎng),囊胚率均高于對照組(P＜0.05);桑椹胚階段換入含糖CZB中的序貫培養(yǎng),囊胚率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2-細(xì)胞、4-細(xì)胞階段換入含糖CZB中的序貫培養(yǎng)與全程在含糖CZB中的兩步法單一培養(yǎng)及一步法單一培養(yǎng),囊胚率分別為46.5%、38.4%、41.7%、56.6%,其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 在小鼠早期胚胎體外發(fā)育中,2-細(xì)胞至桑椹胚前對葡萄糖存在依賴性;盡管序貫培養(yǎng)是有效的,但并不一定優(yōu)于一步單一培養(yǎng)。

小鼠;早期胚胎;培養(yǎng)方法;葡萄糖;序貫培養(yǎng);單一培養(yǎng)

Abstract:Objective To seek the app rop riate way fo r the culture of mouse early embryos in vitro.Methods One-cell embryos were collected from the oviducts of ICR femalemice,super-ovulated and cultured in glucose-free CZB.The embryos,respectively at two-cell,four-cell or morula stage,were removed from glucose-free CZB medium and p laced in CZB medium supp lemented w ith 3.0 mmol/L glucose(op timal concentration).The embryos in the o ther two group swere cultured in CZB supp lemented w ith 3.0 mmol/L glucose during the entire culture time w ith or w ithout renewal of medium.The embryos in the control group were continuously cultured in glucose-free CZB.Embryo development was reco rded at 24 h,48 h,72 h and 96 h respectively culture.Results (1)Shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB at two-cell o r four-cell stage,the blastocyst rates significantly increased compared w ith the control group.(2)The blastocyst rates of w hich the embryos were continuously cultured in glucose-containing CZB during the entire culture time w ith or w ithout renewal of medium,were significantly higher than that of the control group.(3)Shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB atmorula stage,the blastocyst rates did not increase compared w ith the control group.(4)The blastocyst rates,shift embryos from glucose-free CZB to glucose-containing CZB at two-cell o r four-cell stage and continuously cultured in glucose-containing CZB during the entire culture time w ith o r w ithout renewal of medium,were 46.5%,38.4%,41.7%and 56.6%respectively,but there were no significant differences among groups.Conclusion Exposure of embryos to glucose,beginning at the two-cell and extending to themo rula stage,is necessary for the developmentof ICR mouse embryos in vitro.Sequential Culture is sufficient,but is not necessarily superior to continuous Culture without renewal of medium.

Key words:mouse;early embryo;culturalmethod;glucose;sequential culture;continuous culture

隨著人類輔助生殖技術(shù)、轉(zhuǎn)基因、核移植、胚胎干細(xì)胞、基因打靶等生命科學(xué)領(lǐng)域高新技術(shù)的深入開展,人們要求獲得更多的囊胚率及更高質(zhì)量的胚胎,如何提高胚胎體外培養(yǎng)的囊胚率及胚胎的發(fā)育質(zhì)量,關(guān)鍵之一是改進(jìn)胚胎體外培養(yǎng)條件使其更接近體內(nèi)發(fā)育環(huán)境。目前,改進(jìn)哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)主要采取以下方法:(1)改進(jìn)培養(yǎng)液成分;(2)與體細(xì)胞或體細(xì)胞條件液共同培養(yǎng);(3)序貫培養(yǎng)。其中序貫培養(yǎng)近年來已成為研究的熱點(diǎn)。

序貫培養(yǎng)是指按照體外培養(yǎng)胚胎在不同發(fā)育時期代謝需求的不同,配制成一系列不同成分的培養(yǎng)液,進(jìn)行序列更換,從而延長胚胎在體外的培養(yǎng)時間,增加體外篩查機(jī)會,獲得囊胚移植,以期提高妊娠率的方法。胡泊等[1]研究證實(shí),2-細(xì)胞期的小鼠胚胎經(jīng)過序貫培養(yǎng)獲得的8-細(xì)胞期胚胎率、桑椹期胚胎率及囊胚率均顯著高于單一培養(yǎng)組,說明序貫培養(yǎng)方法的應(yīng)用,可以使具有發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)胚胎增多,從而使達(dá)到囊胚期的胚胎數(shù)增加。而Biggers等研究表明,不更換培養(yǎng)基,使用KSOMAA培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)5 d,其囊胚的產(chǎn)量與更換培養(yǎng)基無差別,另有前瞻性隨機(jī)研究,比較單一復(fù)合培養(yǎng)(不包括共培養(yǎng))和序貫培養(yǎng)對人類IVF囊胚發(fā)育的影響,結(jié)果表明,在囊胚形成率、植入率及妊娠率方面沒有差別[2]。目前序貫培養(yǎng)是否優(yōu)于單一培養(yǎng)意見不一。本研究將 ICR小鼠1-細(xì)胞胚胎分別放入無糖CZB及含糖CZB中進(jìn)行單一培養(yǎng)和序貫培養(yǎng),比較其差異性,以期獲得一條穩(wěn)定的早期胚胎體外培養(yǎng)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 ICR小鼠購自昆明醫(yī)學(xué)院動物科,葡萄糖由美國Sigma公司提供,白色粉末;孕馬血清促性腺激素(p regnant mare serum gonadotropin,PM SG)由寧波第二激素廠生產(chǎn),每支1 000 u,白色粉末;絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)由瑞士雪蘭諾大藥廠生產(chǎn),每支5 000 u,白色粉末;配制CZB培養(yǎng)基和CZB-HEPES液的各試劑均購自美國Sigma公司,礦物油購自美國Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)液 培養(yǎng)用的CZB培養(yǎng)基參照Chato t配方,CZBHEPES在CZB配方的基礎(chǔ)上加入 HEPES-Na 20 mmol/L,NaHCO3降至5 mmol/L,BSA用 PVA代替,上述培養(yǎng)液用0.22μm孔徑的微孔膜過濾后放置4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。CZB培養(yǎng)基與一定比例葡萄糖混合,配制成含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養(yǎng)液。

1.3 動物的超排 選取6～8周的 ICR雌鼠和8～10周的ICR雄鼠,實(shí)驗(yàn)前雌鼠先腹部注射10 u PMSG,間隔46～48 h腹部注射10 u HCG,隨后與雄鼠按1∶1比例合籠交配,次晨檢查陰栓,有陰栓者提示已交配。

1.4 胚胎的收集 在注射 HCG后22～26 h,將有陰栓的雌鼠用頸椎脫臼法處死,取1-細(xì)胞胚胎定為第1天,75%乙醇消毒腹部后,打開腹腔,分離輸卵管并除去黏附的血液和脂肪,剪下輸卵管迅速將其置于預(yù)溫的hepes液中,于解剖鏡下用連有1 m L注射器的5號針頭將輸卵管壺腹部明顯膨大處穿破,使胚胎流出,如果受精卵還被顆粒細(xì)胞包裹,用移液槍將胚胎移入透明質(zhì)酸酶300 u/mL中,消化去除顆粒細(xì)胞,經(jīng) CZBHEPES洗滌2次,在Nikon40倒置顯微鏡下觀察胚胎形態(tài),挑選有第二極體或雙原核的形態(tài)正常的受精卵用于體外培養(yǎng)。

1.5 胚胎培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用微滴法培養(yǎng),每滴中按10個胚胎/20μL培養(yǎng)液的密度放置鼠胚。培養(yǎng)皿于培養(yǎng)前1 d準(zhǔn)備,并放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中平衡一夜,從每只雌鼠中獲得的胚胎均被平均分配到各組中,這樣每個培養(yǎng)滴中含有多個雌鼠的胚胎。胚胎在37℃、5%CO2和飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)96 h。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期的工作中,作者前期對CZB培養(yǎng)基中碳水化合物(葡萄糖)作了一定的研究,發(fā)現(xiàn)葡萄糖對 ICR小鼠胚胎體外發(fā)育起重要作用,在CZB培養(yǎng)基中,小鼠胚胎體外培養(yǎng)的最適葡萄糖濃度為3.0 mmol/L,故選擇葡萄糖的濃度為3.0 mmol/L[3]。將從 ICR小鼠體內(nèi)取出的1-細(xì)胞胚胎按隨機(jī)分組的原則分別放入以下各培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分6組:1組(對照組),胚胎培養(yǎng)全程均在不含葡萄糖的CZB培養(yǎng)液中。2組,1-細(xì)胞至2-細(xì)胞階段在無糖CZB培養(yǎng)基中,2-細(xì)胞至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養(yǎng);3組,1-細(xì)胞至4-細(xì)胞階段在無糖CZB培養(yǎng)基中,4-細(xì)胞至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養(yǎng);4組,1-細(xì)胞至桑椹胚階段在無糖CZB培養(yǎng)基中,桑椹胚至囊胚階段移入含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB中培養(yǎng);5組,地胚胎培養(yǎng)全程在含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養(yǎng)液中,1～5組在體外均更換一次培養(yǎng)液,更換培養(yǎng)液時移動一次胚胎,移動胚胎時勿將胚胎遺失;6組,胚胎培養(yǎng)全程均在含3.0 mmol/L葡萄糖的CZB培養(yǎng)液中,培養(yǎng)全程不更換培養(yǎng)液,無胚胎移動。2～6組為實(shí)驗(yàn)組,具體操作見圖1。每組胚胎均在體外培養(yǎng)96 h,觀察2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率、桑椹胚率、囊胚率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包,對各階段發(fā)育率的比較采用卡方檢驗(yàn)。

圖1 不同培養(yǎng)階段更換培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠早期胚胎的示意圖

2 結(jié) 果

表1 不同培養(yǎng)方法對1-細(xì)胞小鼠胚胎體外發(fā)育的影響

不同的培養(yǎng)方法對1-細(xì)胞小鼠胚胎體外發(fā)育的影響。2-細(xì)胞、4細(xì)胞階段從無糖CZB更換到含糖CZB中的序貫培養(yǎng),囊胚率高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)全程均在含糖CZB中,其中更換一次培養(yǎng)液的單一培養(yǎng)囊胚率高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);培養(yǎng)全程均在含糖CZB中,不更換培養(yǎng)液的單一培養(yǎng)囊胚率高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);桑椹胚階段從無糖CZB中更換到含糖CZB中的序貫培養(yǎng),囊胚率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各實(shí)驗(yàn)組2-細(xì)胞率、3-8細(xì)胞率、桑椹胚率與對照組及各實(shí)驗(yàn)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2-細(xì)胞、4-細(xì)胞更換培養(yǎng)液的序貫培養(yǎng)與培養(yǎng)全程在含糖CZB中的單一培養(yǎng)囊胚率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);培養(yǎng)全程均在含糖CZB中移動一次胚胎的單一培養(yǎng)與培養(yǎng)全程均在含糖CZB中不移動胚胎的單一培養(yǎng)囊胚率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。具體結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 不同階段葡萄糖對胚胎發(fā)育的影響 更新培養(yǎng)基的原因之一是在培養(yǎng)的某一階段除去某些有害物質(zhì),比如氨;另一個原因是考慮到胚胎植入前生理和代謝方面的重要變化。第二考慮依賴于兩個假說。第一個假說認(rèn)為,當(dāng)植入前胚胎從輸卵管向子宮移動的過程中其內(nèi)環(huán)境發(fā)生了變化。這個假說現(xiàn)存的證據(jù)是 Gardner[4]和Lane[5]關(guān)于非妊娠婦女輸卵管液及子宮液中葡萄糖和丙酮酸的分析資料。該研究資料顯示,在人類輸卵管液中,葡萄糖濃度隨著月經(jīng)周期的循環(huán)而變化,卵泡階段是3.11 mmol/L,月經(jīng)中期降到0.50 mmol/L,黃體期升至2.32 mmol/L;子宮液中葡萄糖的濃度恒定為3.15 mmol/L。輸卵管液中丙酮酸的濃度恒定于0.24 mmol/L,子宮液中丙酮酸的濃度恒定于0.1 mmol/L。第二個假說認(rèn)為,隨著胚胎的代謝,胚胎所處環(huán)境中的化學(xué)成分發(fā)生了變化。這個假說的理論基礎(chǔ)是,在動物模型和人類胚胎的早期發(fā)育中,丙酮酸的利用超過葡萄糖,而到桑椹胚階段,恰恰相反,葡萄糖的利用超過丙酮酸。優(yōu)先利用葡萄糖或丙酮酸似乎由于輸卵管液與子宮液中葡萄糖和丙酮酸濃度上的差異造成。但這種解釋缺乏嚴(yán)密性,因?yàn)樗雎粤艘稽c(diǎn),只要環(huán)境中所給化學(xué)成分的濃度在允許的范圍內(nèi),胚胎可能從中選擇性地利用其所需要的化學(xué)成分。

本實(shí)驗(yàn)將ICR小鼠1-細(xì)胞胚胎單一培養(yǎng)于無糖CZB與含糖CZB中,同時序貫培養(yǎng)于無糖CZB及含糖CZB中,分別觀察各自的發(fā)育情況。研究結(jié)果顯示:2-細(xì)胞、4-細(xì)胞更換入含糖CZB中的序貫培養(yǎng)囊胚率顯著高于無糖CZB組,而與單一培養(yǎng)于含糖CZB組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。桑椹胚階段更換入含糖CZB中的序貫培養(yǎng)囊胚率明顯低于在含糖CZB組中的單一培養(yǎng),而與無糖CZB組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示,除了丙酮酸、乳酸作為胚胎發(fā)育的重要能量底物之外,葡萄糖也是重要的能量物質(zhì)或者對胚胎早期發(fā)育存在重要支持,它對胚胎的卵裂和囊胚的形成有很大影響。葡萄糖究竟于何階段起作用及其作用如何?本實(shí)驗(yàn)顯示,2-細(xì)胞、4-細(xì)胞以后補(bǔ)充葡萄糖,囊胚率顯著提高,僅僅于桑椹胚及以后階段添加葡萄糖無法逆轉(zhuǎn)胚胎發(fā)育,囊胚形成率很低,提示小鼠胚胎體外發(fā)育在2-細(xì)胞以后桑椹胚前對葡萄糖存在依賴性,此時培養(yǎng)液中補(bǔ)充葡萄糖是必要的。2-細(xì)胞以后添加葡萄糖囊胚率增加,可能由于胚胎早期卵裂主要依靠丙酮酸和乳酸供能,2-細(xì)胞以后隨著卵裂速度加快,胚胎逐步動用葡萄糖,此時胚胎基因組由母源性調(diào)控轉(zhuǎn)移到合子型調(diào)控,葡萄糖能量代謝途徑開放,故2-細(xì)胞以后添加葡萄糖是必要的。然而,胚胎致密化后即桑椹胚階段再補(bǔ)充葡萄糖為時已晚,囊胚率仍很低?？赡艿脑蛴?(1)在無糖的情況下,胚胎主要利用丙酮酸及乳酸代謝供能,但這種能量供給是有限的,若無其他能量物質(zhì)替代只能支持胚胎發(fā)育到桑椹胚,不能支持胚胎后期的發(fā)育;(2)桑椹胚階段加糖仍不能補(bǔ)救,可能由于桑椹胚期葡萄糖代謝途徑受限,也可能由于囊胚的形成必須通過提前代謝葡萄糖儲備某些物質(zhì),其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 序貫培養(yǎng)與單一培養(yǎng)對小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響早期人們對于序貫培養(yǎng)認(rèn)識尚不深刻,自從用于成功培養(yǎng)人類合子至囊胚階段的連續(xù)培養(yǎng)液 G1、G2出現(xiàn)[5](G1培養(yǎng)液是為了支持到8-細(xì)胞階段的發(fā)育,G2培養(yǎng)液是為了支持8-細(xì)胞階段到囊胚的發(fā)育),序貫培養(yǎng)受到研究者的密切關(guān)注。由于序貫培養(yǎng)有利有弊,利在胚胎發(fā)育的不同時期對不同物質(zhì)的需求,弊在胚胎體外培養(yǎng)過程中反復(fù)的體外操作可能對胚胎發(fā)育造成影響。因此,不少研究者力求在單一培養(yǎng)上有所突破。

為進(jìn)一步研究比較序貫培養(yǎng)與單一培養(yǎng)的差異,本研究結(jié)果顯示,一步法全程含糖培養(yǎng)的囊胚率最高,序貫培養(yǎng)囊胚率均有所下降,表明在本研究范圍內(nèi),序貫培養(yǎng)似乎不能改善胚胎最終的發(fā)育結(jié)局。該結(jié)論并不支持胡泊等的研究,造成上述差異的原因可能與小鼠的品系、培養(yǎng)液的成分、樣本量的大小、胚胎培養(yǎng)時期、試劑來源等不同相關(guān)。Swain等[6]研究證實(shí),葡萄糖對哺乳動物胚胎早期發(fā)育沒有抑制作用,故一開始就加入葡萄糖的單一培養(yǎng)并不影響胚胎的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論,2-細(xì)胞、4-細(xì)胞階段開始添加葡萄糖的序貫培養(yǎng)并不能提高小鼠胚胎體外培養(yǎng)的囊胚率。

另一方面,一步單一培養(yǎng)及兩步單一培養(yǎng)的囊胚率分別為56.6%、41.7%,其囊胚獲得率偏低(一般應(yīng)大于80%),可能與自配的培養(yǎng)液有關(guān)。雖然兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但相關(guān)的數(shù)據(jù)表明,兩步單一培養(yǎng)囊胚率有所下降,說明移動胚胎對胚胎體外發(fā)育還是造成一定影響,尚且移動胚胎后胚胎質(zhì)量有否受損目前尚不明確。由于序貫培養(yǎng)同樣需要進(jìn)行移動胚胎的操作,移動胚胎既增加了體外的操作又可能對胚胎發(fā)育造成影響,因此,序貫培養(yǎng)雖然是有效的,但并不一定優(yōu)于一步單一培養(yǎng)。

[1] 胡泊,孫云霞,史敏,等.序貫培養(yǎng)對小白鼠胚胎體外發(fā)育的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003,26(4):368.

[2]Macklon NS,Pieters M H,Hassan MA,et al.A p rospective randomized comparison of nsequential versus monoculture system s fo r in-vitro human blastocyst development[J].Hum Rep rod,2002,17:2700.

[3] 丁芳,周紅林,劉洋,等.葡萄糖對 ICR小鼠胚胎體外發(fā)育的影響[J].動物學(xué)研究,2007,28(5):501.

[4] Gardner DK,Lane M,Calderon I,et al.Environment of the p reimplantation human embryo in vivo:metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells[J].Fertil Steril,1996,65:349.

[5] Gardner DK,Lane M.Culture and selection of viable human blastocysts:a feasible p roposition fo r human IVF.Hum[J].Rep rod Update,1997,3:367.

[6] Swain JE,Bormann CL,Clark SG,et al.Use of energy substrates by various stage p reimp lantation pig embryo p roduced in vivo and in vitro[J].Rep roduction,2002,123:253.

Study on culturalmethod of mouse early embryos in vitro

D ING Fang1,L I Zhi-ying1,ZHOU Hong-lin2△,et al.
(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Renhe Hospital of Three Gorges University,Yichang,Hubei 443001,China;2.Department of Gynecology,2nd A ffiliated Hospital of Kunm ing M edical College,Kunm ing,Yunnan 650101,China;3.Kunm ing Institute of Zoology,the Chinese Academ y of Sciences,Kunm ing,Yunnan 650223,China)

R321.4;R-332

A

1671-8348(2010)08-0907-03

△通訊作者,電話:13577178497;E-mail:zhouxy36@yahoo.com。

2009-08-05

2009-09-28)