鐘俐強(qiáng),楊斯皓,賈鈺銘,吳敬波

(四川省宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科 644000)

pGEX-4T-2-TK原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)*

鐘俐強(qiáng),楊斯皓,賈鈺銘,吳敬波△

(四川省宜賓市第二人民醫(yī)院腫瘤科 644000)

目的構(gòu)建含胸苷激酶基因(TK自殺基因)的pGEX-4T-2-TK原核表達(dá)質(zhì)粒,觀察其在大腸桿菌中表達(dá)情況,為腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增TK基因片段,利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ將其連接至原核表達(dá)載體pGEX-4T-2內(nèi),再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,挑取單菌落,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測序。將轉(zhuǎn)化正確的大腸桿菌培養(yǎng)過夜,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后觀察蛋白表達(dá)情況。結(jié)果TK基因片段成功連接至載體pGEX-4T-2中,在大腸桿菌BL21中可得到穩(wěn)定表達(dá)的目的蛋白。結(jié)論pGEX-4T-2-TK原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,為后續(xù)腫瘤基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

自殺基因;質(zhì)粒構(gòu)建;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

目前放療與化療為惡性腫瘤的主要治療手段,但腫瘤中乏氧細(xì)胞的存在是導(dǎo)致放、化療失敗的重要原因?；蛑委煹某霈F(xiàn)給惡性腫瘤的治療提供了新的思路[1]。TK基因是近年來研究最多的自殺基因,全稱為人類單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk),可與更昔洛韋(ganciclovir,GCV)一起組成HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)[2]。為此,本實(shí)驗(yàn)將TK基因插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2內(nèi),并觀察其在大腸桿菌BL21中的蛋白表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染厭氧菌(如雙歧桿菌)后能否解決腫瘤乏氧區(qū)放、化療抗拒,以為提高治療效果打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與載體 質(zhì)粒pORF-HSVtk購自Invivogen公司,表達(dá)型質(zhì)粒載體pGEX-4T-2由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生院汪川老師惠贈(zèng),大腸桿菌BL21由四川瀘州醫(yī)學(xué)院附院分子生物學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒、BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶、T4 dNA連接酶購自TaKaRa公司;LB培養(yǎng)基購自青島海博公司;SDS-PAGE電泳全套試劑盒購自天根生化公司,引物按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南引物設(shè)計(jì)原則,并且加入特定的酶切位點(diǎn),由賽百盛生物公司合成。

上游引物:5′-CGCGGATCC ATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACAC-3′BamH I;下游引 物:5′-ACGCGTCGAC TCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGG-3′Sal I。

1.2 方法

1.2.1 pORF-HSVtk、pGEX-4T-2質(zhì)粒的抽提 大腸桿菌DH5α100μ L加入50 mL LB液體培養(yǎng)基,250 r/min 37℃搖菌過夜。用OMEGA公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒(按說明書進(jìn)行操作)。

1.2.2 目的基因片段的擴(kuò)增及回收 以pORF-HSVtk質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴(kuò)增TK基因片段。50 μ L反應(yīng)體系中含10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μ L、質(zhì)粒 DNA 模板 1.0 μ L、dNTP(2.5 mM)4μ L 、上下游引物各 1 μ L、TaqDNA 聚合酶(2 u/μ L)1 μ L。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性 5 min后,94℃變性60 s,55℃退火90 s,72℃延伸75 s,35個(gè)循環(huán)后,72℃最終延伸20 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線燈下切割含有目的條帶的凝膠塊,利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收。

1.2.3 目的基因片段與載體連接及鑒定BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切目的基因片段和pGEX-4T-2載體,后在T4 dNA連接酶作用下,16℃連接過夜,構(gòu)建pGEX-4T-2-TK重組質(zhì)粒。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Nishimmra法[3]制備的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上過夜培養(yǎng)。選取平板上生長狀態(tài)良好的單個(gè)陽性菌落適量擴(kuò)增后提取質(zhì)粒 DNA,行BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。

1.2.4 重組質(zhì)粒測序 將鑒定正確的菌落接種至含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的 LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增.取適量菌液送測序。測序工作由英駿公司完成。

1.2.5 目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) (1)將攜帶有重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-TK的大腸桿菌接種至5 mL含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的 LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng);(2)將過夜菌按1∶50比例分別接種到5 mL含相應(yīng)抗生素的新鮮LB管中,37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)1.5～3 h,至菌液的OD600 nm值達(dá)到0.6～0.8;(3)加IPTG誘導(dǎo)前從各管菌液中分別取出1 mL,保存在4℃冰箱中,作為未誘導(dǎo)對(duì)照;(4)在各管菌液中加入IPTG,使其終濃度為1 mM,25℃150 r/min誘導(dǎo)過夜;(5)分別用1.5 mL離心管收集誘導(dǎo)前后樣品各1 mL,12 000 r/min離心1 min,棄去上清液,收集菌體;(6)在菌體沉淀中加入1×SDS上樣緩沖液(可根據(jù)菌體沉淀量相應(yīng)調(diào)整上樣緩沖液量),重懸混勻,于100℃水浴煮沸6 min,SDS-PAGE上樣前12 000 r/min離心2 min;(7)取 10～20 μ L上清液上樣,進(jìn)行 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;(8)0.1%考馬斯亮藍(lán)G-250染液染膠,脫色至蛋白條帶清晰可見時(shí),分析蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的含EB的瓊脂糖凝膠電泳,紫外線燈下可見熒光條帶,TK基因片段約為1 100 bp,擴(kuò)增的片段大小與預(yù)計(jì)一致,見圖1。

圖1 TK基因的PCR擴(kuò)增電泳圖譜

圖2 pGEX-4T-2-TK重組質(zhì)粒的雙酶切

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-TK分別用BamH I、Sal I酶切,切出片段約為 1 100 bp,4 900 bp,與預(yù)計(jì)大小一致,見圖2。

2.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-TK測序鑒定 DNA測序結(jié)果與GENBANK提供的TK基因序列完全一致,同源性達(dá)100%,從第25個(gè)堿基開始為TK基因序列,第19～24堿基為引物的5′端添加的限制性酶切位點(diǎn) BamHⅠ,第 16～18堿基為引物的5′端添加的3個(gè)保護(hù)堿基;第15堿基之前為載體pGEX-4T-2上的序列。證明TK基因己成功克隆到克隆載體pGEX-4T-2內(nèi),見圖 3。

圖3 pGEX-4T-2-TK重組質(zhì)粒測序鑒定部分序列結(jié)果

2.4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-TK在大腸桿菌中的表達(dá) 陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,較未添加IPTG組可見目的蛋白條帶產(chǎn)生,說明作者構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒成功,可以表達(dá)目的蛋白,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求,見圖4。

圖4 pGEX-4T-2-TK蛋白在BL2l中的表達(dá)

3 討 論

理想的腫瘤基因治療載體應(yīng)具備的最重要特性就是對(duì)宿主無毒性以及對(duì)腫瘤的高度靶向性[4]。現(xiàn)階段腫瘤基因治療載體系統(tǒng)主要包括病毒載體系統(tǒng)[5]和非病毒載體系統(tǒng),病毒載體系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及單純皰疹病毒載體,其中腺病毒載體為目前應(yīng)用最廣泛的病毒載體[6-7]。其優(yōu)點(diǎn)是高效轉(zhuǎn)染和高效表達(dá),缺點(diǎn)是腺病毒在感染增殖較快的腫瘤細(xì)胞同時(shí),也會(huì)感染機(jī)體增殖快的正常細(xì)胞,如上皮細(xì)胞,導(dǎo)致一些急性毒性反應(yīng),同時(shí)由于其自身的免疫原性,多數(shù)人群接觸過病毒后體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生病毒特異性抗體,再次應(yīng)用同一種病毒載體會(huì)被首次應(yīng)用產(chǎn)生的大量免疫中和抗體所中和;而且給藥途徑也存在著諸多問題,通過靜脈輸入病毒載體是否安全,尚未得到確認(rèn),目前臨床試驗(yàn)只能靠局部瘤內(nèi)注射給藥。因此病毒載體的毒性反應(yīng)、免疫反應(yīng)及給藥途徑限制了病毒載體在臨床上的應(yīng)用[8]。非病毒載體系統(tǒng)包括:裸DNA、脂質(zhì)體、多聚物及分子耦聯(lián)體,臨床試驗(yàn)中最常用的是真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒[9]。非病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是安全、制備簡單和攜帶外源基因較大;缺點(diǎn)是靶向性差,基因?qū)塍w內(nèi)后轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)水平不夠理想。

研究表明絕大多數(shù)實(shí)體瘤因腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞增生迅速,而血管形成相當(dāng)緩慢,造成實(shí)體瘤內(nèi)部大面積缺氧[10]。雙歧桿菌屬厭氧菌屬,能靶向聚集至腫瘤乏氧區(qū)域[11]。在安全性方面,雙歧桿菌對(duì)人體來說是腸道益生菌,不會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。Sasaki等[12]將轉(zhuǎn)染前藥轉(zhuǎn)換酶基因的長雙歧桿菌通過尾靜脈注射到豚鼠體內(nèi),未見任何過敏反應(yīng)出現(xiàn),也未檢測到由雙歧桿菌介導(dǎo)產(chǎn)生的特殊抗體。因此本實(shí)驗(yàn)用雙歧桿菌作為基因治療運(yùn)載體將TK自殺基因靶向運(yùn)至腫瘤組織,文獻(xiàn)報(bào)道雙歧桿菌自身具有抗腫瘤作用[13-14],康保國等[15]研究表明TK基因可經(jīng)放射誘導(dǎo)表達(dá),可以與放療產(chǎn)生協(xié)同作用,進(jìn)一步提示其是一個(gè)很有前途的腫瘤基因治療運(yùn)輸載體。但雙歧桿菌是原核生物,因此必須要原核表達(dá)質(zhì)粒才能在雙歧桿菌體內(nèi)表達(dá)?；诖?本實(shí)驗(yàn)選用了pGEX-4T-2原核表達(dá)質(zhì)粒,因?yàn)樵撡|(zhì)粒帶有非常強(qiáng)的tac啟動(dòng)子,融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)可以克服轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)外源基因表達(dá)可能帶來的不利影響,便于融合基因翻譯起始,是一種高效的蛋白表達(dá)載體,且便于目的蛋白的進(jìn)一步分離純化。目前TK基因主要與腺病毒基因重組后,再結(jié)合前藥更昔洛韋觀察體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,尚無TK基因與pGEX系列載體重組的報(bào)道。安麗娜等[16]研究表明,將胞嘧啶脫胺酶(CD)自殺基因與pGEX載體重組后再轉(zhuǎn)入雙歧桿菌,自殺基因能很好表達(dá),對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷力。因此將構(gòu)建好的pGEX-4T-2-TK原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雙歧桿菌后,可望克服病毒載體不能靜脈給藥的局限,實(shí)現(xiàn)載體安全性與靶向性的統(tǒng)一。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pGEX-4T-2-TK原核表達(dá)載體,經(jīng)過雙酶切、PCR擴(kuò)增、測序等鑒定表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并在大腸桿菌BL21內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)入雙歧桿菌后能否靶向殺傷惡性腫瘤細(xì)胞打下了基礎(chǔ)。

(志謝:感謝瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科放射生物與生物治療實(shí)驗(yàn)室楊玲麟博士及汪碧瓊老師對(duì)本研究提供的技術(shù)性幫助。)

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Construction and expression of pGEX-4T-2-TK plasmid in procaryote*

Z HONG Li-qiang,Y ANG Si-hao,J I A Yu-ming,et al.
(Department of Oncology,Y ibin Second People's Hospital,Yinbin644000,China)

ObjectiveTo construct the plasmid of pGEX-4T-2-TK containing the TK suicide gene,and then to observe its expression in E.coli.MethodsThe TK suicide gene fragments were amplified from the plasmid of pORF-HSVtk by PCR.The PCR product was digested by the restriction endonucleases BamH I and Sal I.Then we used the same method to deal with the vector of pGEX-4T-2.The recombinant plasmid was transfected into E.coli.The recombinant plasmid was extracted and identified by PCR and enzyme-digestive method,and the sequence was measuerd.The E.coli with correct plasmid was cultured with IPTG over night to induce the protein's express.ResultsThe TK suicide gene fragments were correctly ligated with the vector of pGEX-4T-2.The purpose protein could be expressed stably.ConclusionThe plasmid of pGEX-4T-2-TK was constructed successfully.It will provide the basis for future study on treating carcinoma by transfect the recombinant plasmid into bifidobacterium.

suicide gene;plasmid construction;polymerase chain reaction

R730.54;R446.61

A

1671-8348(2010)09-1036-03

四川省衛(wèi)生廳科研課題(0331)?！?/p>

,E-mail:wjb6147@163.com。

2009-08-30

2009-09-28)

?論 著?