陳紅偉,洪 濤,宋湖平,葉新運,汪 陽

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,南昌 330006)

縫隙連接蛋白43磷酸化在兔腦血管痙攣中的表達(dá)變化*

陳紅偉,洪 濤△,宋湖平,葉新運,汪 陽

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,南昌 330006)

目的研究縫隙連接蛋白43(Cx43)磷酸化在兔2次蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦血管痙攣(CVS)中的表達(dá)變化。方法新西蘭大白兔72只,隨機(jī)分為:正常對照組(18只)、SAH 組(又分 3、7、14 d 3個亞組,每個亞組各18只)。采用枕大池2次注血法建立兔SAH后CVS模型。腦血管造影及光鏡觀察分析基底動脈的直徑及形態(tài)學(xué)變化,應(yīng)用Western blotting檢測Cx43蛋白磷酸化表達(dá)的變化。結(jié)果(1)在SAH后第7天,腦血管造影及光鏡觀察證實基底動脈管腔狹窄程度與形態(tài)學(xué)變化最明顯,第14天逐漸緩解,但與正常對照組相比仍有統(tǒng)計學(xué)意義;(2)Western blotting結(jié)果顯示,SAH后磷酸化的Cx43(P-Cx43)蛋白表達(dá)以第7天表達(dá)最高,14 d開始下降,但仍高于正常對照組;去磷酸化的Cx43(NP-Cx43)蛋白表達(dá)以第7天表達(dá)最低,14 d開始升高,但仍低于正常對照組。結(jié)論SAH后,基底動脈Cx43發(fā)生磷酸化,其表達(dá)水平的變化與CVS發(fā)生發(fā)展的時相性一致,提示Cx43磷酸化可能在CVS的發(fā)生發(fā)展過程中起作用。

縫隙連接;縫隙連接蛋白43;腦血管痙攣;磷酸化

縫隙連接(gap junction,GJ)是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間直接通訊的特殊膜結(jié)構(gòu),在調(diào)節(jié)組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,包括血管系統(tǒng)的舒縮等方面起到了關(guān)鍵作用[1-2]。血管系統(tǒng)GJ主要是由縫隙連接蛋白(connexins,Cxs)Cx43組成,其蛋白的表達(dá)變化在腦血管痙攣(CVS)的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[3-4]。目前有關(guān)Cx43蛋白磷酸化水平的變化與心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病關(guān)系的研究很多[5-8],但國內(nèi)外尚未見其與CVS關(guān)系的研究。作者推測在CVS中,Cx43蛋白磷酸化水平可能發(fā)生改變,并參與CVS發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)研究部提供,所有實驗流程均遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)委員會制定的實驗動物管理條例進(jìn)行。兔抗磷酸化Cx43多克隆一抗購自于Cell Signaling公司;小鼠抗去磷酸化Cx43單克隆一抗購自于Zymed公司;兔抗GAPDH一抗購自于Chemicon公司;辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗和辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG二抗均購自于中山金橋公司;蛋白裂解抽提試劑盒和復(fù)合磷酸酶抑制劑均購自于北京普利萊公司;ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自于美國Pierce公司;照影劑Omnipaque(350 mg/mL)為丹麥生產(chǎn);其余試劑為國產(chǎn)。

1.2 實驗分組 72只體質(zhì)量2.5～3.5 kg的雄性新西蘭大白兔被隨機(jī)分為對照組(n=18)、SAH 組(又分 3、7、14 d 3個亞組,每個亞組n=18)。對照組及SAH各亞組均隨機(jī)選取6只兔子分別行腦血管造影、形態(tài)學(xué)觀察及Western blotting檢測,見表1。

1.3 兔SAH后CVS模型的建立 枕大池2次注血法制成兔SAH后CVS模型[3]。應(yīng)用戊巴比妥(20 mg/kg)耳緣靜脈麻醉動物,頸部備皮消毒后行枕大池穿刺,引出1.5 mL腦脊液后緩慢注入0.5 mL/kg非抗凝自體耳動脈血,立即將動物頭低30°,持續(xù)15 min;次日重復(fù)上述操作。2次注血3 d后為SAH后第3 d,依次類推。正常對照組同樣進(jìn)行穿刺并注入0.5 mL/kg生理鹽水。

表1 實驗兔分組檢查情況

1.4 腦血管造影 用于腦血管造影的實驗兔經(jīng)麻醉后,分別在腦池注血前及2次注血后第3、7、14天行腦血管造影。正常對照組分別于腦池注入生理鹽水前和第7天行腦血管造影。經(jīng)股動脈插入5-F導(dǎo)管至左側(cè)椎動脈,在相同放大率下注入Omnipaque 2 mL后行腦血管造影?；讋用}的直徑應(yīng)用計算機(jī)影像分析系統(tǒng)(NIH Image version 1.62)進(jìn)行測量;每個基底動脈圖像取3個測量點:兩側(cè)椎動脈匯合點上方0.1 mm處,基底動脈中點以及基底動脈頂端下方0.1 mm處;3點測量的平均值作為基底動脈的直徑值。將第2次造影與首次造影基底動脈直徑的百分比值作為最終統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.5 形態(tài)學(xué)觀察 將用于形態(tài)學(xué)觀察的實驗兔在各時間點麻醉后行胸廓切開術(shù),10%中性甲醛灌注固定,迅速開顱取出附有基底動脈全長的腦組織,將標(biāo)本放入固定液中,經(jīng)脫水、包埋、制片等處理后,行HE染色。光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化,包括血管內(nèi)皮細(xì)胞變化、內(nèi)彈力層皺褶及平滑肌細(xì)胞收縮的變化。

1.6 Western blotting檢測Cx43蛋白磷酸化表達(dá)的變化 用于Western blotting檢測的實驗兔在各時間點用戊巴比妥過量麻醉后,快速開顱取出基底動脈,放入液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存。將凍存的血管用液氮研磨后,勻漿,應(yīng)用蛋白裂解抽提試劑盒,再加入復(fù)合磷酸酶抑制劑(1∶100),提取血管總蛋白,Western blotting檢測的具體方法及過程省略。蛋白條帶結(jié)果采用Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以±s表示。運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,首先對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗,組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析,隨后再進(jìn)行Dunnett-t檢驗,兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦血管造影 正常對照組第7天與腦池注入生理鹽水前的基底動脈直徑相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔(97.9±2.3)%,P＞0.05〕;SAH后3 d組與正常對照組相比基底動脈顯著狹窄〔(78.8±2.3)%,P＜0.05〕,SAH 后 7 d組與3 d組相比基底動脈狹窄更加明顯〔(65.1±5.3)%,P＜0.05〕,SAH后14 d組與7 d組相比基底動脈狹窄開始緩解〔(80.9±3.4)%,P＜0.05〕,但與正常對照組相比仍狹窄,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見圖1。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下顯示正常組腦血管內(nèi)皮細(xì)胞排列平整,核橢圓,淡染;其下內(nèi)彈力層光滑;平滑肌細(xì)胞分布均勻,較緊密,核圓鈍。SAH后3 d組出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞變性、皺縮,排列紊亂;內(nèi)彈力層呈波浪狀;平滑肌細(xì)胞肥大,分布稀疏,核呈梭形,內(nèi)彈力層與平滑肌層之間有水腫。SAH后7 d組較SAH后3 d組上述變化更加明顯。SAH后14 d組較SAH后7 d組上述變化明顯減輕,內(nèi)皮細(xì)胞排列趨于平整;內(nèi)彈力層波浪狀基本消失;內(nèi)彈力層與平滑肌層之間水腫減輕,見圖2。

2.3 Western blotting檢測結(jié)果 正?；讋用}Cx43蛋白磷酸化表達(dá)(17.1±2.9)%處于較低水平,SAH后 3 d組(70.0±7.3)%、7 d組(166.8±13.7)%及 14 d組(88.4±9.1)%Cx43蛋白磷酸化表達(dá)與正常對照組相比均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),以7 d組升高最明顯,14 d組開始下降;正?；讋用}Cx43蛋白去磷酸化表達(dá)(36.0±3.7)%處于較高水平,SAH后3 d組(17.2±3.9)%、7 d組(8.0±2.7)%及14 d組(26.2±5.1)%的Cx43蛋白去磷酸化表達(dá)與正常對照組相比均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),以7 d組下降最明顯,14 d組開始升高,見圖3。

圖1 腦血管造影結(jié)果

圖2 各組基底動脈形態(tài)學(xué)變化HE染色(×400)

圖3 Western blotting檢測基底動脈Cx43蛋白磷酸化表達(dá)變化

3 討 論

本研究應(yīng)用兔SAH后CVS模型發(fā)現(xiàn)SAH后第3天出現(xiàn)血管內(nèi)皮變性、皺縮,平滑肌細(xì)胞肥大;第7天上述變化更加顯著;第14天與第7天相比血管變化明顯減輕。結(jié)合腦血管造影進(jìn)一步證實本實驗?zāi)Ｐ偷目煽啃浴?/p>

CVS是SAH后最常見的并發(fā)癥,是SAH患者致殘和死亡的重要原因[9-10]。目前公認(rèn)SAH后CVS是由于血管周圍的凝血塊及其分解產(chǎn)物所致,但其病理機(jī)制不明,因此CVS的機(jī)制探討仍然是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題[11]。

作者前期研究發(fā)現(xiàn),GJ作為一種細(xì)胞間直接信息交流通道,通過參與血管壁各種致痙信號的傳導(dǎo)與調(diào)節(jié)在CVS的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[3-4,12-13]。Cxs中大多數(shù)屬于磷蛋白,處于不同的磷酸化水平。磷酸化是蛋白轉(zhuǎn)錄后非常普遍的一種修飾,是調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要方式之一,通過蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的相互作用,影響Cxs生命周期中的各個過程而調(diào)節(jié)細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap iunctional intercellular communication,GJIC),這些過程涉及到 Cxs的轉(zhuǎn)運、組裝/解離、降解以及通道的門控等[14]。Cx43的磷酸化與去磷酸化對GJ通道的功能有非常重要的影響。已有研究表明,Cx43磷酸化參與GJ重構(gòu),通過改變GJIC影響了心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生[5-8]。但有關(guān)Cx43磷酸化與CVS的研究尚未見報道。本研究從磷酸化的角度,探討兔CVS時Cx43磷酸化水平的變化參與CVS的機(jī)制。

本實驗Western blotting檢測顯示在正常情況下,基底動脈存在磷酸化和非磷酸化2種狀態(tài)的Cx43,其中P-Cx43表達(dá)量較弱,而NP-Cx43表達(dá)量較高。但 Beardslee等[8]研究認(rèn)為正常情況下心肌細(xì)胞間Cx43均以磷酸化形式存在,提示不同組織細(xì)胞間Cx43的存在形式可能不同。在實驗中,SAH后3、7、14 d組與對照組相比 P-Cx43蛋白表達(dá)量均增高,以第 7天表達(dá)量最高,第14天開始下降;各時間點NP-Cx43蛋白表達(dá)量與P-Cx43相反。結(jié)合腦血管造影和HE染色結(jié)果表明,CVS后Cx43蛋白磷酸化表達(dá)變化與腦血管痙攣程度密切相關(guān),提示Cx43蛋白磷酸化可能參與了CVS的發(fā)生、發(fā)展全過程。

研究表明,血凝塊[15]或者其他致痙物質(zhì)(如ET-1[4])可以增強(qiáng)兔血管平滑肌細(xì)胞間GJIC。迄今為止,有關(guān)Cx43特定位點磷酸化與GJIC關(guān)系的研究尚存在爭議。有研究報道,Cx43 Ser368位點磷酸化后可以降低非心肌細(xì)胞GJ的單通道傳導(dǎo)性和對染料的通透性[16];而在體外心臟灌流的實驗研究中Cx43 Ser368位點的去磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞間失偶聯(lián)[8];同時王榮等[17]研究也認(rèn)為Cx43 Ser368位點磷酸化水平的降低導(dǎo)致了細(xì)胞間失偶聯(lián)。本研究采用兔抗P-Cx43多克隆一抗和小鼠抗NP-Cx43單克隆一抗分別特異性針對Ser368位點磷酸化與去磷酸化,因此結(jié)合本實驗結(jié)果作者推測,正常情況下基底動脈Cx43主要以非磷酸化形式存在,CVS后由于血凝塊或其他致痙物質(zhì)(如ET-1)刺激腦血管壁使Cx43由非磷酸化形式向磷酸化形式發(fā)生轉(zhuǎn)變,Cx43 Ser368位點磷酸化水平增高導(dǎo)致基底動脈平滑肌GJIC增加,以致腔內(nèi)外各種致痙信號通過GJ通道向平滑肌細(xì)胞傳導(dǎo)增加,最終引發(fā)CVS。為了進(jìn)一步明確Cx43磷酸化參與CVS病理過程的機(jī)制,仍需深入探討:血凝塊或其他致痙物質(zhì)通過何種途徑使Cx43發(fā)生磷酸化;Cx43磷酸化如何促使平滑肌GJIC增加。

本研究從磷酸化的角度探討了GJ參與CVS的發(fā)病機(jī)制。上述研究結(jié)果表明,SAH后基底動脈Cx43發(fā)生磷酸化,其表達(dá)水平的變化與CVS的發(fā)生、發(fā)展相一致,提示Cx43蛋白磷酸化可能在CVS的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了作用。

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Expression changes of connexin 43 phosphorylation on cerebral vasospasm in rabbits*

CHEN Hong-wei,HONG Tao△,SONG Hu-ping,etal.

(Department of Neurosurgery,First Af filiated Hospital of Nanchang University,Nanchang330006,China)

ObjectiveTo investigate the expression changes of connexin 43(Cx43)phosphorylation in the pathogenesis of cerebral vasospasm(CVS)after experimental subarachnoid hemorrhage(SAH).Methods72 New Zealand pure rabbits were afforded.Models of CVS after SAH were successfully made via double blood injection into the cisterna magna.Angiography and hematoxylin and eosin staining method were respectively performed to observe the diameter and morphological changes of the basilar artery.Western blotting was employed to determine the expression changes of Cx43 phosphorylationin basilar artery.ResultsOn 7 d after SAH,arterial narrowing and morphological changes in vascular structure were significantly more than those in other groups,and the changes were relieved gradually on 14 d after SAH;Western blotting result indicated that the expression of phosphorylated Cx43 protein on 7 d was greater than that in other groups,and it was decreased on 14 d after SAH,but it was still significantly higher than that in control group.And the expression changes of NP-Cx43 protein made a contrast with P-Cx43.ConclusionThere is a coincidence between the expression changes of Cx43 phosphorylation and CVS after SAH in rabbits,implying that Cx43 phosphorylation may play an important function in the happening and progress of CVS.

gap junction;connexin43;cerebral vasospasm;phosphorylation

R365.743

A

1671-8348(2010)09-1027-03

國家自然基金資助項目(30660188);江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(GJJ10325)?！?/p>

,E-mail:ht2000@vip.sina.com。

2009-09-04

2009-11-05)

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