張進(jìn)隆

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅武威733006)

性別控制是奶牛生產(chǎn)中的重要研究課題之一。近年來(lái),隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,人民生活水平的提高,對(duì)乳品需求量迅速地增加,但奶牛的飼養(yǎng)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)于乳品的需求,通過(guò)有效的方法控制奶牛的性別,增加母牛數(shù)量,顯著提高優(yōu)質(zhì)奶牛繁殖效率,最大限度的發(fā)揮母牛的遺傳能力及生產(chǎn)性能。對(duì)一個(gè)奶牛場(chǎng)來(lái)說(shuō),增加母牛的數(shù)量,不僅能有效提高奶牛的產(chǎn)母率,加快優(yōu)質(zhì)奶牛擴(kuò)繁速度,而且可顯著提升奶牛種群的整體質(zhì)量。奶牛的性別控制主要從三個(gè)方面進(jìn)行,即精子的有效分離、早期胚胎性別鑒定和受精環(huán)境的控制。

1 精子的流式細(xì)胞分離

通過(guò)有效的方法分離X、Y精子,選擇X或 Y精子進(jìn)行受精,在受精時(shí)就決定了奶牛性別。由于牛X精子DNA含量比Y精子高3.8%～4.4%、以精子DNA含量不同為依據(jù)的流式細(xì)胞分離技術(shù)是最有效的分離方法[1～3],流式細(xì)胞分離技術(shù)包括精液稀釋,精液與熒光染料Hoeschst33342共同培養(yǎng),染料滲入精子膜從而使DNA著色,由于著色量與DNA量成正比,因此X精子發(fā)出的熒光比Y精子強(qiáng),放射出的熒光信號(hào)通過(guò)儀器和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)擴(kuò)增,當(dāng)精子離開(kāi)激光系統(tǒng)進(jìn)入流動(dòng)室時(shí),計(jì)算機(jī)對(duì)已經(jīng)識(shí)別的X、Y精子充上正電荷或負(fù)電荷,當(dāng)帶電液滴通過(guò)高壓電場(chǎng)時(shí),就會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn),進(jìn)入不同的收集管,達(dá)到分離X、Y精子的目的。1989年Johnson首次報(bào)道利用流式細(xì)胞儀成功分離兔活精子,并通過(guò)人工授精,獲得相應(yīng)性別的仔兔,雄性準(zhǔn)確率81%,雌性準(zhǔn)確率94%,并且在形態(tài)及生育能力上沒(méi)有受到明顯影響[1],之后通過(guò)技術(shù)上的不斷改進(jìn),成功分離牛、羊等動(dòng)物的精子,純度達(dá)到了85%～95%。隨著儀器的改進(jìn),分離的速度及精確度逐年提高,精子分離后的受精效果以及產(chǎn)生后代性別的準(zhǔn)確性都有了明顯提高,流式細(xì)胞儀的重分析是更為準(zhǔn)確的方法。目前,性控精子已經(jīng)在奶牛生產(chǎn)中,開(kāi)始了大規(guī)模商業(yè)化推廣,邰發(fā)紅等[4]利用X性控凍精授配奶牛,母犢率達(dá)到94.9%,比對(duì)照組提高43.8%,取得了明顯的效果。孫國(guó)慶[5]等研究了性控精液對(duì)奶牛情期受胎率及母犢率的影響,性控精液的母犢率(95.45%)極顯著高于常規(guī)精液的母犢率(47.37%)(P<0.01),性控精液的流產(chǎn)率與犢牛成活率與常規(guī)精液差異不顯著(P>0.05)。孫樹(shù)春[6]等用經(jīng)流式細(xì)胞分離儀分離的富含X精子的性控精液及常規(guī)精液對(duì)奶牛進(jìn)行人工授精,性控精液與常規(guī)精液情期受胎率分別為54.81%(74/135)和 60.61%(40/66),兩者之間差異不顯著(P>0.05),試驗(yàn)組所產(chǎn)犢牛母犢率為97.14%(34/35),用性控精液進(jìn)行人工授精所產(chǎn)后代的母犢率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)精液。趙國(guó)琳[7]等用X/Y種畜有限公司生產(chǎn)的奶牛性控凍精,共授配奶牛67頭,懷孕45頭,情期受胎率平均為67.16%;共產(chǎn)犢牛39頭,其中母犢36頭,公犢3頭,死亡6頭,母犢率達(dá)到 92.31%;對(duì)其中 20頭犢牛出生時(shí)的體重、體尺進(jìn)行了階段性測(cè)定,與使用常規(guī)凍精所產(chǎn)母犢的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行比較,兩者差異不顯著(P>0.05)。

3 早期胚胎的性別鑒定

由于在Y染色體短臂上靠近常染色體區(qū)的35kb區(qū)域存在性別決定基因(SRY)。SRY/Sry是決定睪丸分化的候選基因,SRY基因?yàn)殚_(kāi)放的讀碼框架結(jié)構(gòu),可編碼204個(gè)氨基酸肽鍵,其中之一是能編碼80多個(gè)保守氨基酸框架的睪丸決定因子(TDF)基因。SRY基因并不是決定性別的惟一基因,性別決定是以SRY基因?yàn)橹鲗?dǎo)的多基因參與的有序協(xié)調(diào)過(guò)程。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)包括SRY基因在內(nèi)的 6 種 基因(SRY 、SOX9、MIS、WT-1、SF-1、DAX-1)參與了胚胎性別決定中從未分化原始生殖嵴開(kāi)始到兩性內(nèi)生殖器官形成的全過(guò)程,因此,性別決定是一個(gè)多基因級(jí)聯(lián)調(diào)控的過(guò)程,比一般的分化、發(fā)育更復(fù)雜。

胚胎性別鑒定是在胚胎的早期發(fā)育階段,通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)方法鑒定胚胎的性別,選擇相應(yīng)的性別胚胎進(jìn)行移植,來(lái)達(dá)到控制動(dòng)物性別的目的,早期胚胎性別鑒定方法主要有細(xì)胞學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法。PCR法因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),利用雄性特異性基因探針和PCR擴(kuò)增技術(shù),是鑒別胚胎性別的嶄新方法。在早期胚胎的性別鑒定中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。1989年澳大利亞首先成功采用PCR技術(shù)在體外擴(kuò)增牛的染色體特異DNA片段鑒別奶牛胚胎性別,準(zhǔn)確率達(dá)90%以上,1995年歐陽(yáng)紅生[8]等用PCR技術(shù)對(duì)牛胚胎性別進(jìn)行鑒定,準(zhǔn)確率達(dá)100%。然后對(duì)PCR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),利用多重PCR進(jìn)行胚胎性別鑒定的準(zhǔn)確率達(dá)95%以上,并可在24 h完成,由于該法靈敏度高,準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。應(yīng)用兩步PCR法進(jìn)行性別鑒定,成功率達(dá)100%。黃淑幀[9]等應(yīng)用巢式PCR技術(shù)對(duì)試管奶牛和試管山羊的胚胎DNA進(jìn)行SRY基因的測(cè)定。以鑒定其性別,準(zhǔn)確率100%。LAMP法是一種全新的基因擴(kuò)增法,對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)段設(shè)定雄性特異性以及雌雄共同特異性引物,利用特殊的鏈置換型DNA聚合酶,在65℃的恒溫條件下對(duì)胚細(xì)胞中的雄性特異性核酸序列和雌雄共有核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),最后通過(guò)反應(yīng)過(guò)程中獲得的副產(chǎn)物焦磷酸鎂形成的白色沉淀的混濁度來(lái)進(jìn)行早期胚胎的性別鑒定,約需要40 min,靈敏度很高。王海浪[10]利用此法對(duì)牛早期胚胎進(jìn)行檢測(cè),其性別符合率達(dá)100%。黃金明[11]等利用睪丸特異蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非電泳性別鑒定方法,鑒定了 43枚胚胎的性別,對(duì)其中鑒定為雌性的21枚胚胎分別移植給自然發(fā)情后6～8 d的受體,結(jié)果9頭出生的犢牛均為母牛。

4 環(huán)境因素和受精時(shí)間對(duì)性別的影響

性別控制也可以通過(guò)環(huán)境控制來(lái)實(shí)現(xiàn),由于Y精子頭小而圓,體積也小,在相同動(dòng)力下比X精子運(yùn)動(dòng)快,但不耐受疲勞和酸,X精子則剛好相反,所以通過(guò)改變受精環(huán)境的PH值達(dá)到性別控制的目的。吳偉[12]等采用向母牛子宮頸內(nèi)注人5%L型精氨酸,產(chǎn)母牛率分別63.8%,與48.8%的對(duì)照組相比,差異極顯著。研究發(fā)現(xiàn),在母牛排卵前授精易得雌性后代,在接近排卵時(shí)易得雄性后代,在受精當(dāng)時(shí)預(yù)測(cè)的犢牛性別與實(shí)際產(chǎn)犢牛性別的符合率達(dá)到約70%,熊福建[13]等使用性別控制液后配種,母牛的產(chǎn)母犢率可以達(dá)到70%。奶牛的性別控制技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜的生物技術(shù),近年來(lái),奶牛性別控制的方法已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,目前性控精液在奶牛生產(chǎn)中逐步在推廣應(yīng)用,由于早期胚胎的性別鑒定推廣應(yīng)用受到一系列因素的限制,通過(guò)環(huán)境因素的影響獲得的準(zhǔn)確率相對(duì)較低,國(guó)產(chǎn)性控精液成年牛受胎率≥50%,產(chǎn)母牛犢率≥90%,所以是目前有效的奶牛性別控制方法。

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