楊建偉,曹維偉

(山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局,山東壽光262700)

由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的奶牛布魯氏菌病是以感染家畜為主的人獸共患的傳染病,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疫病,我國將其列為二類動(dòng)物疫病。奶牛布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患的接觸性傳染病。主要侵害奶牛生殖道,引起子宮、胎膜、關(guān)節(jié)、睪丸及附睪的炎癥;母牛臨床發(fā)生胎衣停滯、流產(chǎn)及繁殖障礙。在人會(huì)引起發(fā)熱,盜汗,無力,關(guān)節(jié)、頭和全身疼痛[1]。奶牛布魯氏菌病檢測(cè)方法很多,幾乎所有的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法在布病的檢測(cè)中都有過應(yīng)用和研究,而且隨著血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物工程技術(shù)的發(fā)展,奶牛布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)的研究也取得了新的進(jìn)展,現(xiàn)對(duì)近些年來奶牛布魯氏菌病的檢測(cè)技術(shù)研究作一概述,供同行參考。

1 病原學(xué)檢測(cè)

布氏菌屬的細(xì)菌是一組微小的球桿狀的革蘭氏陰性菌。寬0.3～ 0.6 μ,長0.6～1.5 μ。無芽胞 、無鞭毛、不形成莢膜。姬姆薩染色呈紫紅色,柯茲羅夫染色呈紅色,其他菌為綠色。布氏菌生長繁殖對(duì)營養(yǎng)要求較高,生長緩慢,分裂一次時(shí)間約132～227 min。尤其初代分離的野生株生長更慢,通常需5～7 d,有的甚至需20～30 d才可生長出可見的菌落。生長最適溫度為37℃,個(gè)別種型初代生長需一定濃度CO2。對(duì)所有流產(chǎn)奶牛都應(yīng)懷疑是布魯氏菌病并要進(jìn)行調(diào)查,臨床癥狀不具特征性,而畜群史對(duì)診斷有幫助[2]。把胎盤子葉、陰道排泄物和胎兒肺、肝和皺胃內(nèi)容物進(jìn)行涂片,加熱或酒精固定后,用改良的萋——尼氏、科斯特氏、革蘭氏或麥基亞維羅氏方法染色,或用熒光素或過氧化物酶標(biāo)記的抗體結(jié)合物染色。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量堆積物,弱抗酸性布氏桿菌形態(tài)細(xì)菌或具有免疫特性著色的細(xì)菌,則可判定為布氏桿菌病。鑒于其他病原可能具有相似形態(tài)(如貝氏科可氏體、衣原體)或免疫學(xué)交叉反應(yīng)性(如耶爾森氏菌屬),因此解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎[1]。

2 血清學(xué)試驗(yàn)

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)

一種非常簡單的血清學(xué)試驗(yàn),只需在潔凈的玻璃板上取被檢血清0.03 mL與抗原0.03 mL混合,4 min內(nèi)判定結(jié)果,凡出現(xiàn)“+”以上凝集者均為陽性,出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動(dòng)物應(yīng)根據(jù)情況進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)或其他輔助診斷試驗(yàn)。

2.2 試管凝集試驗(yàn)(SAT)

我國布病診斷的法定試驗(yàn)。該試驗(yàn)在試管內(nèi)進(jìn)行。被檢血清用0.5%苯酚生理鹽水作12.5、25、50、100、200 倍稀釋,置于小試管中各 0.5 mL,將抗原用0.5%苯酚生理鹽水作1∶20稀釋,加入上述各管血清中0.5 mL,同時(shí)設(shè)陰、陽血清對(duì)照充分混合后置36～37℃溫箱中24 h,取出靜止15～20 min判定。血清1∶100凝集“++”以上為陽性,1∶50凝集“++”為可疑。

2.3 布病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)

一種特異性較高的血清學(xué)試驗(yàn),通常被檢動(dòng)物群體經(jīng)過虎紅平板凝集試驗(yàn)檢查后若出現(xiàn)可疑反應(yīng)動(dòng)物,就需用SAT或CFT做進(jìn)一步確診。該試驗(yàn)是將被檢血清作成1∶10稀釋,加入2管中每管0.5 mL,再向其中1管加入0.5 mL工作濃度的抗原,此管為試驗(yàn)管;另1管加0.5 mL生理鹽水作為對(duì)照管,然后各加0.5 mL的補(bǔ)體混勻,置于37℃水浴20 min,取出觀察結(jié)果0%～40%溶血為陽性,50%～90%溶血為可疑,100%溶血為陰性。注意稀釋后的抗原必須當(dāng)天用完。

以上三種診斷方法注意事項(xiàng):試驗(yàn)溫度應(yīng)在25～30℃條件下進(jìn)行;所用器材一定要清潔,血清和抗原用量很少,必須用量精確;被檢血清自采血之日起不能超過15天,血清不能凝固腐敗[3]。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

目前市面上可以獲得幾種商品化的用不同抗原制劑,抗球蛋白酶結(jié)合物和底物顯色劑的多種間接ELISA試劑盒,如北京天之泰生物科技有限公司的血清ELISA試劑盒及武漢華美生物工程有限公司的牛布魯氏桿菌IgG抗體ELISA試劑盒等。這些方法通過廣泛的田間試驗(yàn)已得到確認(rèn),而且正被廣泛使用。間接ELISA高度敏感,但不能鑒別流產(chǎn)布氏桿菌19號(hào)免疫接種產(chǎn)生的抗體和病原菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。因此,在檢測(cè)免疫接種過的牛時(shí)更應(yīng)將間接ELISA當(dāng)作一種篩選方法而不是確認(rèn)的方法[4]。采用流產(chǎn)布氏桿菌OPS表位之一的特異單克隆抗體所作的競(jìng)爭ELISA較間接ELISA特異性更高[5～7]。競(jìng)爭ELISA可以排除絕大多數(shù)流產(chǎn)布氏桿菌19株免疫接種產(chǎn)生的殘留抗體的反應(yīng)。如市面上的北京天之泰生物科技有限公司的競(jìng)爭ELISA試劑盒,鑒別免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物,敏感性98%～100%,特異性99.7%～100%。

2.5 熒光偏振試驗(yàn)(FPA)

文獻(xiàn)稱熒光偏振試驗(yàn)(FPA)仍有前景。或許在合適的條件下該法適于應(yīng)用。這種方法是檢測(cè)抗原/抗體相互作用的一種簡便技術(shù),在實(shí)驗(yàn)室或田間都可操作使用。本法屬同源性分析,分析物不需進(jìn)行分離,因而該法快捷。試驗(yàn)步驟如下:①10 mm×75 mm硼硅玻璃管中加1 mL PBSAL緩沖液。管中加10 mL血清或20 mLEDTA處理的血液,在熒光偏振分析儀上讀取光分布值。②以產(chǎn)生熒光強(qiáng)度250×103～300×103的抗原加到管中,混勻。每一批次都不同,但通?？傇?0 uL的范圍。室溫下孵育2 min后在熒光偏振分析儀上讀取第二個(gè)數(shù)值。③高于臨界值的讀數(shù)判為陽性反應(yīng)。④每批試驗(yàn)中都應(yīng)包括:強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性工作標(biāo)準(zhǔn)的血清(用OIE標(biāo)準(zhǔn)血清校準(zhǔn)過)。熒光偏振試驗(yàn)診斷牛布氏桿菌的特異性和敏感性幾乎與競(jìng)爭ELISA相同。診斷新近免疫過流產(chǎn)布氏桿菌19株的牛的特異性大于99%[8]。

3 聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR)

PCR是近來發(fā)展成熟起來的一種體外基因擴(kuò)增技術(shù),能在數(shù)小時(shí)內(nèi)使DNA呈指數(shù)增加,已成功地用于多種細(xì)菌疾病的基因檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查等。其檢測(cè)原理為:尋找傳染性因子的特異DNA序列,對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果檢測(cè)出了相應(yīng)的擴(kuò)增帶,則判為陽性反應(yīng);反之,無擴(kuò)增帶則為陰性反應(yīng)。在布病研究中,采用PCR技術(shù)檢查布氏菌始見于1990年。在國際上,于1995年和1996年將PCR技術(shù)用于布病的診斷探索。在國內(nèi),1995年中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所開始這方面的研究,1997年首次將PCR應(yīng)用于布病病人的診斷。目前,各國各實(shí)驗(yàn)室所報(bào)道的結(jié)果極不一致,差異很大[9]。用PCR技術(shù)檢測(cè)布氏菌的特異性和敏感性研究已經(jīng)報(bào)道很多。用PCR來檢測(cè)奶牛布魯氏菌病在病的早期、快速、微量等病原學(xué)診斷方面具有目前常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)及細(xì)菌培養(yǎng)無可比擬的優(yōu)越性。市面上已有的PCR快速診斷試劑盒如長沙安迪生物有限公司的奶牛布魯氏菌病的PCR快速診斷試劑盒等反應(yīng)良好。

4 膠體金檢測(cè)技術(shù)

膠體金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù),已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌及寄生蟲病的免疫診斷方面。此方法檢測(cè)奶牛布魯氏菌病與其他方法比較。ELISA方法雖具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但操作繁瑣、耗時(shí)多,需要一定的儀器,在基層推廣受到一定限制;PCR技術(shù)用于布病的診斷,因敏感性差,有待提高;試管凝集試驗(yàn)(SAT)雖是一種經(jīng)典布病免疫診斷方法,具有較高的敏感性和特異性,但其操作步驟比較復(fù)雜,使用器械多,血清用量大,檢測(cè)時(shí)間長,需花費(fèi)較多的人力和物力;膠體金標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)具有敏感性強(qiáng),特異性高優(yōu)點(diǎn),且操作簡便,不需任何儀器,血清用量少,檢測(cè)速度快,更適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用,為布病的檢測(cè)提供一種新的手段[10]。目前市面上已有布病膠體金檢測(cè)試紙條銷售,但價(jià)格還比較昂貴。

5 其他方法

5.1 全乳間接ELISA

篩查奶牛群的一個(gè)極其有效的方法是檢測(cè)大罐乳。這種來源的乳樣比血樣既便宜又容易多次采集。當(dāng)檢驗(yàn)出陽性后,所有供奶的牛都應(yīng)作血液檢測(cè)。全乳間接ELISA是最敏感和最特異的方法,尤其在檢測(cè)大群牛時(shí)更有價(jià)值。若作ELISA不方便,全乳環(huán)狀試驗(yàn)(M RT)是一種合適的選樣方法。也可用間接ELISA檢測(cè)個(gè)體動(dòng)物[11]。如同血清間接ELISA,有多種全乳間接ELISA可采用,有幾種商品化的間接ELISA試劑盒,已在廣泛的田間試驗(yàn)中得到驗(yàn)證,且正在廣泛應(yīng)用。如北京天之泰生物科技有限公司的奶樣ELISA試劑盒及武漢華美生物工程有限公司的牛布魯氏桿菌IgG抗體ELISA試劑盒等。

5.2 全乳環(huán)狀試驗(yàn)(MRT)

對(duì)泌乳動(dòng)物,全乳環(huán)狀試驗(yàn)可用來篩查牛群的布氏桿菌病。對(duì)大群牛(多于100頭泌乳牛),本試驗(yàn)的敏感性會(huì)降低其可靠性。對(duì)新近免疫的牛(免疫后不超過4個(gè)月),或者對(duì)含有異常乳(如初乳或因患乳房炎而產(chǎn)生的異常乳)的樣品,可能會(huì)發(fā)生假陽性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)將1滴30 uL標(biāo)準(zhǔn)牛種布氏桿菌全乳環(huán)狀試驗(yàn)抗原加到已在4℃保存24 h以上的1 mL全乳中,試管中乳樣高度至少25 mm以上。乳樣品不應(yīng)凍結(jié)、加熱或劇烈振蕩。全乳-抗原混合物與陽性和陰性對(duì)照一同在37℃作用1 h,不過,于4℃過夜孵育可增加試驗(yàn)的敏感性,試驗(yàn)容易判讀。當(dāng)乳柱頂部形成一個(gè)深藍(lán)色環(huán)時(shí),則判為強(qiáng)陽性。對(duì)于乳和乳脂層界面出現(xiàn)藍(lán)色層,應(yīng)視作陽性。如果下部乳的顏色超過乳脂層的顏色,則判為陰性[12]。

5.3 布魯氏菌素皮膚試驗(yàn)

取0.1 mL布氏桿菌素,在尾褶、肋腹部或頸側(cè)部皮內(nèi)注射,48～72 h判定試驗(yàn)結(jié)果。局部腫脹變硬為陽性反應(yīng)。建議在注射前,應(yīng)用Vernier卡尺測(cè)量注射部位皮膚厚度,并于48～72 h后再檢查,強(qiáng)反應(yīng)易辨認(rèn),但弱反應(yīng)需要細(xì)心判斷[13]。盡管布氏桿菌素皮下試驗(yàn)是布病診斷中最為特異的一種方法,不應(yīng)單獨(dú)依據(jù)畜群中少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)陽性皮內(nèi)反應(yīng)而作出診斷,而應(yīng)有可靠的血清學(xué)試驗(yàn)如ELISA進(jìn)一步證實(shí)。

[1]賈幼陵.哺乳動(dòng)物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[2]秦發(fā)才,吳天保,滕進(jìn)禮.奶牛布魯氏菌病診斷、處理的分析與思考[J].中國牛業(yè)科學(xué),2009,35(4):88-89.

[3]孫耀貴,黃美生,程 佳.三種血清學(xué)方法檢測(cè)奶牛布魯氏菌病的比較試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2005,(1):4-5.

[4]WrightP F,Tounkara K,Lelenta M,et al.International reference Standards:antibody standards for the indirect enzymelinked immunosorbent assay[J].Rev.Sci.T ech.2002,3:824-832.

[5]M acMillan A P,Greiser-Wilke I,M oennig V,et al.A competition enzyme immunoassayfo rbrucellosisdiagnosis[J].DtschTierarztl.Wocherschr,1990,97:83-85.

[6]Nielsen K,Kelly L,Gall D,et al.Improved competitive enzyme immunoassayfo rthediagnosisofbovinebrucellosis[J].Vet.Immunol.Immunopathol,1995,46:285-291.

[7]Stack J A,Perrett L L,Brew S D,et al.cELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples[J].Vet.Record,1997,145:735-736.

[8]Nielsen K,Gall D,Jolley M,et al.A homogenous fluorescence polarisation assay for detection of antibody to Brucella abortus[J].J.Immunol.Methods,1996,195:161-168.

[9]姜風(fēng)華,于 剛.布魯氏菌PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)2008,(2):4-5.

[10]朱明東,楊 蓉,洪林娣,等.快速診斷布魯氏菌病膠體金免疫層析法的建立[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,(7):1344-1345.

[11]Pouillot R,Garin-Bastuji B,Gerbier G,et al.T he brucellin skin test as a tool to differentiate false positive serological reactions in bovine brucellosis[J].Vet.Res,1997,28:365-374.

[12]Adone R,Francia M,Ciuchini F,et al.A melitensis B115-based complement fixation test to detect antibodies induced by Brucella rough strains[J].J Appl Microbiol.2008,105(2):567-574.

[13]Ewalt D R,Bricker B J.Validation of the abbreviated Brucella as a rapid screening method for differentiationof Brucella abortus field strain isolates and the vaccine strains[J].J Clin Microbiol,2000,38:3085-3086.