楚琰，吳興安

DNA 疫苗（DNA vaccine）又稱為核酸疫苗、基因疫苗，是指將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的質(zhì)粒載體作為疫苗，采用某種方法直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，然后通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，從而使被接種動(dòng)物獲得相應(yīng)的免疫保護(hù)，以達(dá)到預(yù)防和（或）治療疾病的目的。1990年，Wolff 等[1]發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌細(xì)胞能捕獲含外源基因的質(zhì)粒并表達(dá)外源基因，首次提出了基因免疫的概念。1992年，Tang 等[2]將含生長(zhǎng)激素基因的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠表皮細(xì)胞，88%的被免疫小鼠產(chǎn)生了抗生長(zhǎng)激素抗體，二次免疫后抗體水平顯著提高。隨后的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明在合適的條件下，DNA 接種后既能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，又能產(chǎn)生體液免疫。于是，基因疫苗技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并逐漸顯示出作為第3 代疫苗的優(yōu)越性。

最近幾年來(lái)，關(guān)于基因免疫的研究在世界范圍內(nèi)廣泛展開，所涉及的范圍包括人和動(dòng)物的各種細(xì)菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲病及腫瘤性疾病。目前，在醫(yī)學(xué)上針對(duì)結(jié)核桿菌、艾滋病病毒、流感病毒和 T 細(xì)胞淋巴瘤的基因疫苗已進(jìn)入臨床階段；而針對(duì)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、狂犬病病毒、牛皰疹病毒、人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)癌癥、巨細(xì)胞病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒、瘧原蟲、利什曼病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的核酸疫苗也正處于研究和開發(fā)之中。

雖然 DNA 疫苗研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足的進(jìn)展，但多數(shù)DNA 疫苗，尤其是針對(duì)大型動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的 DNA 疫苗的免疫效果仍不理想，普遍存在免疫原性低、誘發(fā)的抗體滴度低以及不能完全清除病毒感染的問(wèn)題，妨礙了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。因此，探索提高 DNA 疫苗有效性的策略和方法是目前 DNA 疫苗研制的重要環(huán)節(jié)。已有的研究表明，多種因素影響 DNA 疫苗的免疫效果，如目的基因的選擇、質(zhì)粒載體的選擇、免疫佐劑的選擇等，其中免疫途徑的選擇是一個(gè)重要方面。DNA 疫苗存在多種不同的免疫途徑，不同免疫途徑和免疫方式可對(duì)抗原 DNA 的吸收、表達(dá)和遞呈產(chǎn)生影響，從而誘導(dǎo)出不同強(qiáng)度的免疫反應(yīng)，其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制也各不相同[3]?，F(xiàn)有資料表明，不同 DNA 疫苗最佳的接種方式不同。因此，需根據(jù)客觀情況進(jìn)行優(yōu)化選擇。

本文就 DNA 疫苗免疫途徑的研究進(jìn)展作一綜述。

1 注射免疫法

所謂直接注射法就是將重組質(zhì)粒 DNA 直接注射到動(dòng)物或人體的不同部位，如肌肉、靜脈、腹腔、皮內(nèi)和皮下等。該法需要大量重組質(zhì)粒 DNA，但操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜設(shè)備，是一種常用的方法。

1.1 肌肉注射

目前大部分研究者認(rèn)為包括骨骼肌和心肌在內(nèi)的橫紋肌系統(tǒng)是最有效的攝取外源基因的組織[4]。肌肉組織具有安全、體積大、免疫接種容量大的優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)可以長(zhǎng)期分泌治療性蛋白的有效平臺(tái)，能引起有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此多被用來(lái)進(jìn)行 DNA 免疫注射[5]。但是肌肉組織缺少相關(guān)的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，故其抗原提呈能力較弱。將質(zhì)粒 DNA 注射進(jìn)入肌肉組織后，最多只有1%～2%的肌纖維被轉(zhuǎn)染，而影響質(zhì)粒 DNA 擴(kuò)散的主要屏障是肌束膜[4]。盡管如此，但由于肌肉組織的骨骼肌細(xì)胞可通過(guò) T 小管或溝隙攝取 DNA，且可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，因而其內(nèi)化質(zhì)粒 DNA 及表達(dá)編碼基因蛋白的能力遠(yuǎn)優(yōu)于其他類型細(xì)胞，從而成為DNA 疫苗最主要的免疫方法之一。DNA 轉(zhuǎn)染的效率還與質(zhì)粒 DNA 的大小、構(gòu)型、肌細(xì)胞的狀態(tài)等有十分密切的關(guān)系。一般而言，DNA 分子越小，越有利于肌細(xì)胞的攝取，反之則擴(kuò)散和攝取的效率越低。超螺旋閉合環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒構(gòu)象對(duì)質(zhì)粒進(jìn)入肌細(xì)胞并在其中有效表達(dá)是十分有利的；而線性或開環(huán)的雙鏈質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)染效率則較低。對(duì)肌細(xì)胞而言，處于再生狀態(tài)的肌細(xì)胞攝取質(zhì)粒 DNA 的能力較強(qiáng)。

研究表明[6]，肌肉內(nèi)接種誘發(fā)的免疫類型以 Th1 型為主，包括激活 CD8+ 的 CTL，CD4+ 的 Th1 細(xì)胞以及產(chǎn)生 IgG2a 為主的 B 淋巴細(xì)胞，且所獲得的免疫力隨免疫次數(shù)增加而不斷加強(qiáng)。其產(chǎn)生 Th1 型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的機(jī)制除與巨噬細(xì)胞和 NK 細(xì)胞活化產(chǎn)生 Th1 類細(xì)胞因子有關(guān)外，尚與肌肉的部位有關(guān)。骨骼肌所屬淋巴結(jié)為周圍淋巴結(jié)，其內(nèi)有較多 Th1 類細(xì)胞及可提供 Th0 向 Th1 類細(xì)胞分化的微環(huán)境，這也是骨骼肌成為比較理想的肌注部位的原因之一。

1.2 靜脈注射

有文獻(xiàn)顯示[7]，靜脈注射的免疫保護(hù)效率與肌注無(wú)顯著差異。主要是由于雖然靜脈注射導(dǎo)入 DNA 的轉(zhuǎn)染率很低，但其內(nèi)豐富的抗原提呈細(xì)胞及其對(duì)特異抗原的識(shí)別和高效提呈，能夠彌補(bǔ)轉(zhuǎn)染率的不足。

1.3 腹腔注射

腹腔注射由于可迅速吸引眾多巨噬細(xì)胞吞噬處理侵入的異物，所以獲得免疫應(yīng)答的速度較快，應(yīng)答水平較高，但維持時(shí)間較短。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腹腔內(nèi)注射裸 DNA 載體，可轉(zhuǎn)染脾臟的 T 淋巴細(xì)胞和骨髓來(lái)源的造血干細(xì)胞，但是，極低的轉(zhuǎn)染效率以及缺乏有效的抗原呈遞作用，使得該途徑的免疫保護(hù)效率很低。

1.4 皮內(nèi)注射和皮下注射

皮膚是阻止外來(lái)病原進(jìn)入體內(nèi)的屏障，是一個(gè)復(fù)雜而有效的免疫監(jiān)視器官，含有大量的專職抗原提呈細(xì)胞，如郎罕細(xì)胞（LC）和樹突狀細(xì)胞（DC）。皮內(nèi)注射位點(diǎn)多樣，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以在尾根部（離臀部皮膚 1cm 處）、腹部皮膚、足墊和耳廓等處，不同的注射位點(diǎn)引起的免疫應(yīng)答機(jī)制不同[8]。皮下或皮內(nèi)途徑傳遞抗原可誘導(dǎo)出較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以 Th1 型反應(yīng)為主[9-10]。研究顯示，下頜下腺附近皮下注射 DNA 疫苗是一種較好的抵御口腔感染性疾病的策略。Guo 等[11]將帶有葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTFs）的C 末端糖苷結(jié)合區(qū)域（GLU）基因的 pGLUA 質(zhì)粒，皮下注射免疫 SD 鼠，發(fā)現(xiàn)在唾液中誘生的特異性分泌型 IgA（sIgA）滴度顯著高于經(jīng)肌肉注射時(shí)唾液中的特異性 sIgA，且皮下注射途徑也可誘導(dǎo)出血清中特異性抗細(xì)胞表面 A蛋白（PAc）的 IgG 抗體，顯示皮下注射途徑可誘導(dǎo)出系統(tǒng)免疫和黏膜免疫。F?rg 等[8]以小鼠為模型，比較了三種不同的接種途徑（骨骼肌、腹部皮膚、耳廓）所誘發(fā)的免疫反應(yīng)，肌肉組織中目的基因表達(dá)時(shí)間最長(zhǎng)，耳廓免疫引起的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答最強(qiáng)，肌肉免疫最弱，由此可見(jiàn)質(zhì)粒表達(dá)持續(xù)時(shí)間與免疫反應(yīng)強(qiáng)弱無(wú)關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)耳廓免疫可優(yōu)先誘導(dǎo)基因免疫反應(yīng)。

2 非注射免疫法

2.1 基因槍法（微彈轟擊法）

基因槍法是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它采用金或鎢微粒為載體，以壓縮氣體（氦或氮）沖擊波為動(dòng)力，把研究人員理想目標(biāo)中的遺傳物質(zhì)附著于高速金顆粒上，直接射入需要改造的動(dòng)、植物細(xì)胞、組織或細(xì)胞器內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。該方法具有技術(shù)簡(jiǎn)單，能迅速、方便地轉(zhuǎn)移基因，對(duì)于任何處于靜止期或分裂期的靶細(xì)胞都可以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，用比普通的注射法低 2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)的 DNA 即可產(chǎn)生較高的保護(hù)作用，對(duì)治療基因的大小要求不嚴(yán)格，安全性很高，可以獲得持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的瞬時(shí)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)[12]，是目前廣泛應(yīng)用且十分高效的免疫方法。

基因槍免疫無(wú)論是其介導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)還是其所需的 DNA 疫苗劑量，均優(yōu)于肌注途徑[13]。肌內(nèi)注射所需DNA 疫苗的劑量是獲得同等程度抗體反應(yīng)的基因槍免疫所需 DNA 劑量的 100～1000 倍[14]。Fynan 等[7]用基因槍將甲型流感病毒的 DNA 疫苗送入小鼠的表皮中，發(fā)現(xiàn)僅用 0.4 μg 的 DNA 免疫 2 次即可使 90%的小鼠抵抗隨后的病毒攻擊，而肌內(nèi)注射則需要 100 μg 的劑量。這可能是由于肌內(nèi)注射途徑中 DNA 是從細(xì)胞外被攝取，而基因槍途徑則是 DNA 直接被轟擊定位至細(xì)胞漿[15]。此外，Yoshida 等[16]還發(fā)現(xiàn)基因槍介導(dǎo)的免疫實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于肌肉注射。但是基因槍設(shè)備昂貴，子彈制作成本高，目前尚不具備普遍使用的條件。

2.2 表皮劃痕法

所謂表皮劃痕法即先用 70%酒精擦洗小鼠耳背皮膚，然后以注射針頭劃痕，再將溶于含 1%SDS 的 TE 溶液中的質(zhì)粒 DNA 涂于劃痕部位，其中 SDS 為透皮吸收促進(jìn)劑。段明星等[17]將乙型肝炎病毒表面抗原基因質(zhì)粒pGFP-HBsAg，分別采用肌肉注射、腹腔注射、表皮劃痕三種免疫途徑和不同劑量的裸露質(zhì)粒 DNA 給小鼠進(jìn)行免疫，以 ELISA 檢測(cè)小鼠血清中抗 HBsAg 抗體變化。結(jié)果表明表皮劃痕方式免疫的小鼠陽(yáng)性率最高，且在相同劑量下其抗體滴度水平也最高，反應(yīng)強(qiáng)度與他們?cè)?jīng)使用基因槍免疫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。但這方面工作還需進(jìn)一步研究，以尋求更好的方法來(lái)提高基因轉(zhuǎn)移效率，獲得最佳免疫效果。

2.3 黏膜免疫法

黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中重要的組成部分。黏膜表面是大部分病原生物侵入機(jī)體的主要部位。與非黏膜免疫相比，黏膜免疫除可引起機(jī)體產(chǎn)生全身免疫應(yīng)答（如 IgG）外，還可誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生 sIgA，從而有效地提高機(jī)體的免疫保護(hù)力；同時(shí)，該免疫方法還具有給藥途徑安全、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)[18]。非侵入性黏膜免疫途徑包括鼻內(nèi)吸入、滴鼻、直腸內(nèi)給藥、陰道內(nèi)給藥、滴眼、口服、口內(nèi)噴射接種等。據(jù)報(bào)道，所有黏膜免疫途徑中以滴鼻效果最好。因?yàn)楸乔簧掀ひ捉臃N，對(duì)大分子物質(zhì)較少排斥，表面蛋白酶水平低于腸道[19]。Mora 和 Tam[20]報(bào)道，給麻醉小鼠鼻腔免疫包裹 HIV-1 包膜糖蛋白 gp120 的肽聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）微球可誘導(dǎo)出 gp120 相關(guān)的 CTL 和免疫應(yīng)答，也能引起小鼠全身 CTL 應(yīng)答。

黏膜免疫的機(jī)制包括誘生 sIgA、產(chǎn)生抗原提呈細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)型 T 細(xì)胞[19]等。

2.4 電穿孔技術(shù)傳遞質(zhì)粒 DNA

上述傳遞 DNA 疫苗的不同途徑和方法，一般在小動(dòng)物體內(nèi)比靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)更有效。到目前為止，僅少數(shù)實(shí)驗(yàn)在人體內(nèi)觀察到特異性的免疫反應(yīng)，而在大量實(shí)驗(yàn)中并未觀察到特異性的免疫反應(yīng)[21-22]。在靈長(zhǎng)動(dòng)物體內(nèi)未誘導(dǎo)出免疫反應(yīng)的可能原因是 DNA 攝取量低，而電穿孔技術(shù)可克服這一難題。電穿孔通過(guò)脈沖電流增加靶細(xì)胞的滲透性而不致殺傷細(xì)胞，使親水藥物和 DNA 可以透過(guò)細(xì)胞膜；電穿孔技術(shù)能有效地傳遞質(zhì)粒 DNA 至皮膚，在鼠、豬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中質(zhì)粒 DNA 的表達(dá)提高了 100 倍，但其具體機(jī)制不清[23]。Schertzer 等[24]研究顯示：用透明質(zhì)酸酶預(yù)處理小鼠脛前肌，在 75 V/cm 的條件下進(jìn)行電穿孔，經(jīng)檢測(cè)肌纖維表達(dá)報(bào)告基因率達(dá) 22%±5%，而且不會(huì)引起肌肉組織損傷。Otten 等[25]將 HIV 的 DNA 疫苗用電穿孔技術(shù)接種至獼猴體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)攻擊感染的強(qiáng)度，與獼猴產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間呈一定關(guān)聯(lián)，提示利用電穿孔針對(duì)大動(dòng)物傳遞質(zhì)粒 DNA 是一項(xiàng)非常有效的技術(shù)。

3 非常規(guī)的其他免疫途徑

上文所述的各種免疫途徑是目前 DNA 疫苗應(yīng)用較多的、較常規(guī)的免疫途徑，除此之外，近些年還涌現(xiàn)出了一些新的非常規(guī)的免疫途徑。其中，經(jīng)涎腺投遞基因疫苗的方式具有免疫原性強(qiáng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)而受到人們重視。涎腺基因投遞是將外源基因經(jīng)導(dǎo)管逆行灌注投遞至涎腺，繼而表達(dá)基因所編碼的蛋白質(zhì)并將其分泌至血液或唾液，起到基因治療的作用[26]。

涎腺是外分泌腺體，與皮膚和肌肉組織不同的是，涎腺的解剖與生理功能使其成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)的理想器官[27]，其解剖特點(diǎn)特別適用于基因疫苗的投遞[28]：①涎腺有蛋白合成及分泌系統(tǒng)；②涎腺腺體分泌的蛋白可經(jīng)基底膜至血液，經(jīng)頂膜至唾液；③涎腺可通過(guò)導(dǎo)管系統(tǒng)無(wú)創(chuàng)逆行注射各種基因；④腺體的腺泡和導(dǎo)管均由單層細(xì)胞構(gòu)成，一次注射即可將基因投遞到絕大多數(shù)細(xì)胞；⑤經(jīng)導(dǎo)管投遞基因較經(jīng)血液投遞后針對(duì)載體的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)輕得多。研究表明，經(jīng)涎腺投遞的基因疫苗不僅能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，還能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜免疫[29-32]。Voutetakis 等[33]把攜帶人促紅細(xì)胞生成素基因的腺病毒相關(guān)病毒載體投遞至小鼠涎腺，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后 10 周分泌入血液中的人促紅細(xì)胞生成素濃度達(dá)到最高，轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá) 54 周以上，小鼠的血液紅細(xì)胞壓積明顯提高，且與血清促紅細(xì)胞生成素含量呈正相關(guān)。王松靈等[34-37]在大鼠與小型豬體內(nèi)經(jīng)導(dǎo)管逆行投遞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步在小型豬涎腺放射損傷動(dòng)物模型上轉(zhuǎn)導(dǎo)水通道基因獲得成功[36]，證明大型動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)涎腺逆行投遞基因的可行性。經(jīng)涎腺投遞基因疫苗，可以預(yù)防或治療口腔、消化道或全身疾病，雖然這方面的研究才剛剛起步，但其有潛在的發(fā)展前景。

4 多種途徑聯(lián)合免疫

研究表明，多種免疫途徑聯(lián)合使用策略，其免疫效果優(yōu)于單種途徑的免疫。Kudo-Saito 等[38]比較了用含有癌胚抗原（CEA）和三聯(lián)的 T 細(xì)胞共刺激分子（B7-1、ICAM-1、LFA-3）的痘苗病毒（rV-CEA /TR ICOM）經(jīng)不同途徑接種的免疫效果和保護(hù)率，其免疫效果為初免皮下接種，再瘤內(nèi)接種加強(qiáng)的聯(lián)合免疫策略要優(yōu)于皮下接種和瘤內(nèi)接種單獨(dú)免疫。Fynan 等[7]比較了甲型流感病毒血凝素 DNA 疫苗經(jīng)不同途徑接種的免疫效果和保護(hù)率，結(jié)果無(wú)論是小鼠還是雞，其免疫效果均以多種途徑聯(lián)合免疫為最好。

5 結(jié)語(yǔ)

DNA 疫苗是 21 世紀(jì)新型疫苗發(fā)展的趨勢(shì)，它不僅有可能成為病毒、細(xì)菌或寄生蟲等感染性疾病的預(yù)防性疫苗，同時(shí)也可能作為非感染性疾病、腫瘤、自身免疫疾病等的治療性疫苗。目前，DNA 疫苗已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。DNA 疫苗的接種有多種途徑，不同的免疫途徑，誘導(dǎo)免疫保護(hù)力的強(qiáng)弱和維持的時(shí)間也不盡相同。各種途徑各有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，皮內(nèi)注射（耳廓）誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答較強(qiáng)，肌肉注射誘導(dǎo)的免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，黏膜免疫不僅誘導(dǎo)黏膜免疫還可誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫，電穿孔技術(shù)對(duì)大動(dòng)物免疫效率較高，基因槍免疫質(zhì)粒用量少，免疫效果較好，而各種接種途徑的聯(lián)合運(yùn)用可能是新的研究方向。今后，還需要進(jìn)一步研究，闡明各種接種途徑的免疫機(jī)制，以尋求更好的接種方法來(lái)提高基因轉(zhuǎn)移的效率，獲得最佳的免疫保護(hù)效果。

[1]Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science, 1990, 247(4949 Pt 1):1465-1468.

[2]Tang DC, Devit M, Johnston SA.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.Nature, 1992, 356(6365):152-154.

[3]Da'dara AA, Skelly PJ, Fatakdawala M, et al.Comparative efficacy of the Schistosoma mansoni nucleic acid vaccine, Sm23, following microseeding or gene gun delivery.Parasite Immunol, 2002, 24(4):179-187.

[4]Ertl HC, Xiang Z.Novel vaccine approaches.J Immunol, 1996,156(10):3579-3582.

[5]McMahon JM, Wells DJ.Electroporation for gene transfer to skeletal muscles: current status.BioDrugs, 2004, 18(3):155-165.

[6]Xu XM, Song GX, Si JY.Advance in research on DNA vaccine.Prog Microbiol Immunol, 2002, 30(1):65-70.(in Chinese)許雪梅, 宋國(guó)興, 司靜懿.DNA疫苗機(jī)制研究進(jìn)展.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2002, 30(1):65-70.

[7]Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al.DNA vaccines: Protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations.Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(24):11478-11482.

[8]F?rg P, von Hoegen P, Dalemans W, et al.Superiority of the ear pinna over muscle tissue as site for DNA vaccination.Gene Ther, 1998,5(6):789-797.

[9]Ayash-Rashkovsky M, Weisman Z, Zlotnikov S, et al.Induction of antigen-specific Th1-biased immune responses by plasmid DNA in schistosoma-infected mice with a preexistent dominant Th2 immune profile.Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282(5):1169-1176.

[10]Liu L, Zhou X, Liu H, et al.CpG motif acts as a ‘danger signal’ and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination.Immunology, 2005, 115(2): 223-230.

[11]Guo JH, Jia R, Fan MW, et al.Construction and immunogenic characterization of a fusion anti-caries DNA vaccine against PAc and glucosyltransferase I of Streptococcus mutans.J Dent Res, 2004,83(3):266-270.

[12]Wang YB, Yu XL.The development of gene gun technology.Mod Scientific Instruments, 2003, (3):41-45.(in Chinese)王友冰, 余興龍.基因槍技術(shù)發(fā)展綜述.現(xiàn)代科學(xué)儀器, 2003, (3):41-45.

[13]Trimble C, Lin CT, Hung CF, et al.Comparison of the CD8+ T cell responses and anti-tumor effects generated by DNA vaccine administered through gene gun, biojector, and syringe.Vaccine, 2003,21(25/26): 4036-4042.

[14]Pertmer TM, Eisenbraun MD, McCabe D, et al.Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA.Vaccine, 1995, 13(15):1427-1430.

[15]Eisenbraun MD, Fuller DH, Haynes JR.Examination of parameters affecting the elicitation of humoral immune responses by particle bombardment-mediated genetic immunization.DNA Cell Biol, 1993,12(9):791-797.

[16]Yoshida A, Nagata T, Uchijima M, et al.Advantage of genegun-mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immune responses.Vaccine, 2000, 18(17):1725-1729.

[17]Duan MX, Zhuang FF, Zhou ZH, et al.A comparative study on the inoculation routes of gene immunization.Shanghai J Immunol, 1999,19(5):275-276, 279.(in Chinese)段明星, 莊峰鋒, 周志紅, 等.幾種不同基因免疫途徑的比較研究.上海免疫學(xué)雜志, 1999, 19(5):275-276, 279.

[18]MacDonald TT.The mucosal immune system.Parasite Immunol,2003, 25(5):235-246.

[19]Czerkinsky C, Anjuere F, McGhee JR, et al.Mucosal immunity and tolerance: relevance to vaccine development.Immunol Rev, 1999,170:197-222.

[20]Mora AL, Tam JP.Controlled lipidation and encapsulation of peptides as a useful approach to mucosal immunizations.J Immunol, 1998,161(7):3616-3623.

[21]Wang R, Doolan DL, Le TP, et al.Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine.Science, 1998, 282(5388):476-480.

[22]Calarota S, Bratt G, Nordlund S, et al.Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients.Lancet, 1998,351(9112):1320-1325.

[23]Giri M, Ugen KE, Weiner DB.DNA vaccines against human immunodeficiency virus type 1 in the past decade.Clin Microbiol Rev,2004, 17(2):370-389.

[24]Schertzer JD, Plant DR, Lynch GS.Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.Mol Ther, 2006, 13(4):795-803.

[25]Otten G, Schaefer M, Doe B, et al.Enhancement of DNA vaccine potency in rhesus macaques by electroporation.Vaccine, 2004, 22(19):2489-2493.

[26]Hai B, Wang SL.Advance in research on genetic therapy of salivary glands.Foreign Med Sci, 2006, 33(2):87-89.(in Chinese)海波, 王松靈.涎腺基因療法的研究進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè),2006, 33(2):87-89.

[27]Goldfine ID, German MS, Tseng HC, et al.The endocrine secretion of human insulin and growth hormone by exocrine glands of the gastrointestinal tract.Nat Biotechnol, 1997, 15(13):1378-1382.

[28]Wang SL.Non-tumor salivary gland diseases.Beijing: Science and Technology Press, 2001:206-216.(in Chinese)王松靈.涎腺非腫瘤疾病.北京: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2001:206-216.

[29]Kawabata S, Terao Y, Fujiwara T, et al.Targeted salivary gland immunization with plasmid DNA elicits specific salivary immunoglobulin A and G antibodies and serum immunoglobulin G antibodies in mice.Infect Immun, 1999, 67(11):5863-5868.

[30]Sankar V, Baccaglini L, Sawdey M, et al.Salivary gland delivery of pDNA-cationic lipoplexes elicits systemic immune responses.Oral Dis, 2002, 8(6):275-281.

[31]Tucker SN, Lin K, Stevens S, et al.Systemic and mucosal antibody responses following retroductal gene transfer to the salivary gland.Mol Ther, 2003, 8(3):392-399.

[32]Tucker SN, Lin K, Stevens S, et al.Salivary gland genetic vaccination:a scalable technology for promoting distal mucosal immunity and heightened systemic immune responses.Vaccine, 2004, 22(19):2500-2504.

[33]Voutetakis A, Kok MR, Zheng C, et al.Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics.Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9):3053-3058.

[34]Wang SL, Baum BJ, Yamano S, et al.Adenoviral-mediated gene transfer to mouse salivary glands.J Dent Res, 2000, 79(2):701-708.

[35]Li J, Zheng C, Zhang X, et al.Developing a convenient large animal model for gene transfer to salivary glands in vivo.J Gene Med, 2004,6(1):55-63.

[36]Shan Z, Li J, Zheng C, et al.Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1 cDNA to irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Ther, 2005, 11(3):444-451.

[37]Shan ZC, Li J, Liu XY, et al.Adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1 cDNA to irradiatedminipig parotid glands.Beijing J Stomatology, 2005, 13(3):141-144.(in Chinese)單兆臣, 李鈞, 劉曉勇, 等.水通道基因治療小型豬腮腺放射損傷的研究.北京口腔醫(yī)學(xué), 2005, 13(3):141-144.

[38]Kudo-Saito C, Schlom J, Hodge JW.Intratumoral vaccination and diversified subcutaneous/intratumoral vaccination with recombinant poxviruses encoding a tumor antigen and multiple costimulatory molecules.Clin Cancer Res, 2004, 10(3):1090-1099.