熊艷蕾 綜述 賈心善 審校

肺癌是當(dāng)今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率近年來呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類健康。在我國的許多省市和地區(qū)，肺癌的發(fā)病與死亡近十年來一直居惡性腫瘤之首位。雖然臨床上已經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)、化療、放療等治療方案，但肺癌患者五年生存率仍不高，尋找新的治療途徑可能有利于肺癌的預(yù)后。

依據(jù)腫瘤干細(xì)胞理論推斷，肺癌可能是一種干細(xì)胞疾?。壕哂凶晕腋潞蜔o限增殖能力的肺癌干細(xì)胞是肺癌發(fā)生的根源；肺癌的復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥、抗輻射等惡性表型特征都與肺癌干細(xì)胞有關(guān)。本文綜合了肺癌干細(xì)胞最新研究進(jìn)展及其在肺癌形成中的重要作用，同時為肺癌治療提供了新的思路。

1 肺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與分離

1.1 利用細(xì)胞表面的分子標(biāo)記分選肺癌干細(xì)胞 Kim等[1]利用流式細(xì)胞儀從大鼠細(xì)支氣管和肺泡管結(jié)合部（the bronchioalveolar duct junction, BADJ）分離出一群CD45+/Pecam-/Sca-1+/CD34+細(xì)胞，其在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時發(fā)生增殖，能夠分化為其他類型的肺上皮細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的自我更新特性，Kim將其命名為支氣管肺泡干細(xì)胞（bronchoalveolar stem cells, BASCs）。體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)K-ras基因（原癌基因）激活可導(dǎo)致BASCs增殖更新；成鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BASCs在肺癌發(fā)生早期可出現(xiàn)數(shù)目增多和體積增大，與肺癌起始有關(guān)，被認(rèn)為是肺腺癌的靶細(xì)胞。最近，Regala等[2]發(fā)現(xiàn)非典型蛋白激酶C （protein kinase C, PKC ）的激活可促進(jìn)BASCs增殖和向肺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

Eramo等[3]則認(rèn)為肺癌干細(xì)胞屬于CD133+細(xì)胞，然而上述類型肺癌干細(xì)胞的致瘤性較弱，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下需植入1×104個CD133+細(xì)胞才能形成腫瘤，這些肺癌干細(xì)胞是否具有小鼠BASCs特征，目前尚不清楚。但最近有學(xué)者對此提出異議[4]，他們應(yīng)用免疫磁珠從A549和H446肺癌細(xì)胞系中分離出CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞，二者均具備相似的自我更新、侵襲及耐受化療藥物能力。此外，40%以上的CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞均可形成較大克隆，這提示僅表達(dá)CD133尚不能作為A549和H446細(xì)胞系干細(xì)胞的標(biāo)記物。Hayashi等[5]檢測了CD133在小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD133幾乎僅表達(dá)于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系內(nèi)很少表達(dá)，且CD133+小細(xì)胞肺癌細(xì)胞致瘤能力均強(qiáng)于非小細(xì)胞肺癌，但由于CD133表達(dá)過于廣泛，不應(yīng)作為分選肺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物。

最近Chen等[6]從肺癌標(biāo)本及肺癌細(xì)胞系中分離出了CD133+肺癌細(xì)胞（LC-CD133+）和CD133-肺癌細(xì)胞（LCCD133-），并發(fā)現(xiàn)高表達(dá)OCT4基因的LC-CD133+有明顯自我更新能力和無限增殖潛能，體內(nèi)外放化療實(shí)驗(yàn)均表明，LC-CD133+對放化療抵御能力與OCT4基因表達(dá)有關(guān)，OCT4是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時也是體外建立誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的關(guān)鍵基因，作者推斷OCT4基因?qū)τ诰S持 LC-CD133+的干細(xì)胞特性和耐化療能力有重要意義。

Giangreco等[7]認(rèn)為位于近端氣道粘膜下腺體/內(nèi)軟骨環(huán)、神經(jīng)上皮小體和終末細(xì)支氣管/支氣管肺泡交叉處的氣道干細(xì)胞具有致癌特性，如高增殖能力、多向分化潛能和較長存活壽命。

美國學(xué)者[8]應(yīng)用流式細(xì)胞儀從人類肺癌細(xì)胞系中分選出醛脫氫酶-1（aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1）陽性的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具備諸多干細(xì)胞特征，并表達(dá)CD133；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明：ALDH1+細(xì)胞具備可形成與母代細(xì)胞異質(zhì)性相同的腫瘤。此外，免疫組織化學(xué)分析303例臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達(dá)與肺癌的分期和分級以及患者預(yù)后相關(guān)。因此作者大膽推測ALDH1可能是肺癌標(biāo)記物和肺癌潛在的預(yù)后因子。

1.2 利用側(cè)群細(xì)胞分選法分離肺癌干細(xì)胞 加拿大學(xué)者Ho等[9]應(yīng)用Hoechst33342染色和熒光激活細(xì)胞分選方法，在6種肺癌細(xì)胞株（A549, H460, H23, HTB-58, H441, H2170）中分離出側(cè)群細(xì)胞（side population cell, SP），并證實(shí)SP細(xì)胞具有自我更新、分化和高致瘤性的特征，并且發(fā)現(xiàn)其具備干細(xì)胞“永生”和處于靜止?fàn)顟B(tài)的特征，高表達(dá)抗凋亡因子和端粒酶mRNA，而標(biāo)志細(xì)胞增生的MCM7基因mRNA表達(dá)下調(diào)。因此他們認(rèn)為肺癌的腫瘤干細(xì)胞主要富集在側(cè)群細(xì)胞組分中，表達(dá) ABCG2等ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette, ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

Seo等[10]在研究A549人肺腺癌細(xì)胞株腫瘤干細(xì)胞AKRICI/C2、TM4SFl、NROBI基因表達(dá)時，他們利用SP細(xì)胞分選法成功將對數(shù)生長期的細(xì)胞分離為SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞AKRICL/C2、TM4SFl、NROBI基因表達(dá)上調(diào)并且具備腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征。

2 肺癌干細(xì)胞與肺癌形成

2.1 正常肺臟干細(xì)胞突變 從理論上來說，一個正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞至少要發(fā)生4-7次突變，這需要幾年或是幾十年的時間。干細(xì)胞生存期長、分裂慢，最有可能長期受有害環(huán)境影響積聚突變向腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。肺臟干細(xì)胞及前體細(xì)胞均有自我更新能力，有充分的時間來接受腫瘤形成所必須的遺傳改變信息。當(dāng)肺內(nèi)正常干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)機(jī)制受損或肺干細(xì)胞積累了惡性變傳遞到肺的前體細(xì)胞，使其經(jīng)歷突變后重新獲自我更新能力，都會導(dǎo)致肺干細(xì)胞無限增生，最終成肺癌[11]。因此，氣管干細(xì)胞方面的研究也顯得較為重要。

賈心善等[12,13]應(yīng)用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）對離體的人及大鼠氣管造成損傷，建立了氣管干細(xì)胞增殖分化動物模型[14]，對氣管干細(xì)胞進(jìn)行了定位研究。結(jié)果顯示：5-FU損傷后，氣管上皮細(xì)胞絕大部分脫落，可見少量間隔分布的類似裸核的細(xì)胞呈釘狀位于基底膜上，PCNA染色陰性，證明為G0期細(xì)胞；去除5-FU后，正是通過這些干細(xì)胞增殖分化，修復(fù)了損傷的氣管環(huán)。該實(shí)驗(yàn)室還證實(shí)，此G0期細(xì)胞能排除Hoechst33342染料，Bcrpl/ABCG2表達(dá)陽性[15]，Song等[16]發(fā)現(xiàn)此G0期細(xì)胞可表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Oct3/4、Nanog和Sox2，進(jìn)一步證明其為氣管干細(xì)胞。此外，該損傷模型還可用于研究氣管損傷修復(fù)過程中某些信號通路的開啟情況及某些細(xì)胞因子的變化情況。

雖然干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，但應(yīng)該注意到它們有著本質(zhì)的不同[17]，例如腫瘤干細(xì)胞自我更新轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)反饋機(jī)制已被破壞，傾向于累積復(fù)制的錯誤，而干細(xì)胞能夠防止復(fù)制錯誤的發(fā)展。此外，干細(xì)胞增殖具有自穩(wěn)定性，其數(shù)目在機(jī)體調(diào)控下保持恒定，而腫瘤細(xì)胞卻無自穩(wěn)定性的特點(diǎn)。

2.2 肺臟干細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控異常 干細(xì)胞生長的微環(huán)境稱之為干細(xì)胞“龕”（niche），它保持干細(xì)胞處于休眠狀態(tài)；阻止其分化；保護(hù)腫瘤干細(xì)胞免于抗癌藥物、放射線的攻擊；通過信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)著腫瘤干細(xì)胞的自我更新、分化、凋亡，影響著腫瘤干細(xì)胞的遷徙與轉(zhuǎn)移。

研究[18,19]發(fā)現(xiàn)肺癌的形成不僅與肺癌干細(xì)胞有關(guān)，肺臟局部微環(huán)境可能也參與肺癌形成，在不同解剖區(qū)域有不同的組織學(xué)表型。鼠類肺癌模型由近端氣管至遠(yuǎn)端氣管，大致分布的主要肺癌組織表型為：鱗癌、小細(xì)胞肺癌、支氣管肺泡癌。這種在不同解剖區(qū)域有不同表型分布的現(xiàn)象提示：僅有少數(shù)散在分離的細(xì)胞及其微環(huán)境支持肺癌生長。K-ras基因變異小鼠模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)：盡管整個小鼠氣道細(xì)胞都發(fā)生了K-ras基因變異，但是僅位于支氣管肺泡區(qū)域的細(xì)胞發(fā)生了腺瘤樣增生。此外，肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一并且在細(xì)支氣管和肺泡處多發(fā)。這表明：肺癌的形成不僅與致癌基因突變有關(guān)，還與不同細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)。利用小鼠鱗癌，腺癌，支氣管肺泡癌模型確定的腫瘤起始位點(diǎn)與最新發(fā)現(xiàn)的氣道干細(xì)胞所處的小生境位置似乎一致[20]。

2.3 肺臟干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制異常 大量實(shí)驗(yàn)研究證明，正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞具有相似的調(diào)節(jié)性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一旦正常干細(xì)胞自我更新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)紊亂則會導(dǎo)致腫瘤增殖或形成腫瘤。目前已經(jīng)清楚腫瘤干細(xì)胞的分化與自我更新受EGF/EGFR、PDGF/PDGFR、Notch和Wnt/β-catenin等通路的調(diào)控[21]。

2.3.1 Wnt通路與肺臟干細(xì)胞 Wnt/β-catenin通路可以調(diào)控細(xì)胞周期，從而維持干細(xì)胞的分化和自我更新。王琳琳等應(yīng)用5-FU大鼠氣管上皮損傷模型，再現(xiàn)了氣管干細(xì)胞原位增殖分化修復(fù)氣管上皮的全過程，結(jié)果表明：Wnt-1時間依賴性表達(dá)與氣管損傷修復(fù)進(jìn)程相吻合，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控氣管干細(xì)胞增殖分化全過程，修復(fù)早期促進(jìn)氣管干細(xì)胞的增殖，修復(fù)后期促進(jìn)祖細(xì)胞向特定的細(xì)胞分化。張菁茹等[22]采用干細(xì)胞基因芯片比較受損氣管上皮在恢復(fù)24 h及48 h與正常氣管上皮基因表達(dá)的差異。24 h后差異基因8個上調(diào)，31個下調(diào)。48 h后5個上調(diào)，42個下調(diào)。差異基因表達(dá)主要集中在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞連接、FGF、BMP分子、Notch、Wnt信號通路上。在肺干細(xì)胞中β-catenin主要通過減弱分化促進(jìn)組織干細(xì)胞數(shù)量的增加，而不是促進(jìn)干細(xì)胞直接增生，其在非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中的作用也需要進(jìn)一步研究[23]。

Mazieres等[24]證實(shí)在肺癌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中存在與上述干細(xì)胞相似的Wnt過度表達(dá)、非經(jīng)典途徑JNK通路激活和Wnt拮抗劑WIF-1的抑制和失活。Nakashima等研究證實(shí)，Wnt-1的過度表達(dá)會使肺癌發(fā)生演進(jìn)。Kim等[25]應(yīng)用轉(zhuǎn)染后含有 Wnt-1抑制因子基因的A549和H460細(xì)胞株，測定細(xì)胞增生，并將含有Wnt抑制因子的脂質(zhì)體注射到移植瘤。結(jié)果表明Wnt-1抑制因子表達(dá)增加可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，使克隆形成率下降，并且重組的Wnt-1抑制因子蛋白能夠抑制 H460的增生，顯著抑制腫瘤的生長。

2.3.2 Notch通路與肺臟干細(xì)胞 在非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的研究中，敲除小鼠基因的實(shí)驗(yàn)研究[26]表明 Notch通路活化在肺的發(fā)育中起重要作用，并且Notch配體、受體和HES1的水平在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中表達(dá)升高，其與癌變的RAS信號關(guān)系密切[27]。應(yīng)用γ-Secretase抑制劑能夠抑制Notch2激活，在體內(nèi)、外均可抑制肺癌的生長[28]。Ma等[29]采用大鼠損傷模型，分析了Notch信號分子Notch-3、Jagged-1和Hey1在氣管干細(xì)胞增殖分化過程中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，Hey-1的Notch信號在氣管干細(xì)胞增殖分化過程中維持氣管干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，促進(jìn)氣管干細(xì)胞的非分化性增殖。

就肺癌而言，其干細(xì)胞和腫瘤形成的關(guān)系正逐步揭曉。理論上，我們認(rèn)為，上述三個條件在肺癌形成過程中均發(fā)揮了作用，但是其具體發(fā)生及調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

3 肺癌干細(xì)胞與臨床治療

3.1 肺癌干細(xì)胞可能與耐藥性密切相關(guān) 目前大量的理論和實(shí)驗(yàn)均表明腫瘤干細(xì)胞可能與耐藥性密切相關(guān)。與正常干細(xì)胞類似，生長緩慢和多處于休眠狀態(tài)有助于腫瘤干細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生。此外，腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá)多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[30]，例如ABCB1基因編碼P2糖蛋白（P-glycoprotein, Pgp）、ABCG2/MXR基因編碼多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multi-drug resistance related protein 1, MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白2（bcl-2），它們具備外排藥物、毒物的能力。ABCG2、ABCB1或ABCC1基因敲除的小鼠對長春堿、異阿凡曼菌素、米托蒽醌等藥物更加敏感[31]，提示ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子可保護(hù)細(xì)胞不受化療藥物影響，也可能經(jīng)過基因突變的積累，腫瘤干細(xì)胞把這種多藥耐藥機(jī)制遺傳下來；或存在基因突變或分化異常導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤出現(xiàn)了多藥耐藥性，這就可以解釋為什么本來不具有耐藥性的腫瘤在化療后復(fù)發(fā)獲得多藥耐藥性。

Sung等[32]也發(fā)現(xiàn) A549細(xì)胞株的側(cè)群細(xì)胞亞群有ABCG2基因高表達(dá)，且MDR1和ABCC2基因高表達(dá)，并證明了其與腫瘤耐藥性有關(guān)。

3.2 肺癌干細(xì)胞與肺癌復(fù)發(fā) 肺癌傳統(tǒng)治療方案中，放射療法、化學(xué)藥物療法等被廣泛應(yīng)用于包括肺癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤，但是這些手段往往在治療初期效果顯著，但是維持時間短暫且伴有復(fù)發(fā)現(xiàn)象。放化療手段殺傷的靶細(xì)胞為增殖活躍的肺癌細(xì)胞或定向前體細(xì)胞，而休眠的肺癌干細(xì)胞往往處于G0期，對射線和化學(xué)藥物不敏感，可以抵御放化療的殺傷，成為以后復(fù)發(fā)的根源[33]，這或許可以解釋當(dāng)前治療惡性腫瘤失敗的原因。因此針對腫瘤干細(xì)胞的治療可能效果更持久，靶向去除肺癌干細(xì)胞將是治療肺癌的新突破點(diǎn)。

3.3 清除肺癌干細(xì)胞的可能策略 研制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的阻斷劑進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肺癌干細(xì)胞的耐藥性，充分發(fā)揮化療藥物的療效。目前已批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究的ABCG2抑制劑及其它ABCG2抗體的研究等[34]。

通過調(diào)控關(guān)鍵的信號通路來抑制肺癌干細(xì)胞的自我更新和誘導(dǎo)分化?？梢酝ㄟ^小分子抑制劑如RNAi技術(shù)阻止這些信號通路的活化來治療腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)gamma蛋白分泌酶抑制劑，可以靶向Notch通路來抑制白血病和淋巴瘤細(xì)胞的生長[35]。

改善腫瘤干細(xì)胞的微環(huán)境 ，特別是血管生成。目前已經(jīng)證實(shí)，抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的單克隆抗體-貝伐珠單抗[36]（bevacizumab）對于結(jié)腸癌治療有效?？寡苌芍委熞呀?jīng)應(yīng)用在非小細(xì)胞肺癌的治療中，并使患者的生存獲益[37]。

直接靶定肺癌干細(xì)胞，根據(jù)特異性的表面分子標(biāo)志識別肺癌干細(xì)胞，制備單克隆抗體，攜帶放射性物質(zhì)或化療藥物，直接靶向放化療，最終促使肺癌干細(xì)胞凋亡，使腫瘤失去生成新的腫瘤細(xì)胞的能力，爭取達(dá)到根治的目的。通過腫瘤干細(xì)胞表面的分子抗原進(jìn)行靶向殺傷?，F(xiàn)已應(yīng)用于臨床的吉姆單抗（gemtuzumab）/奧佐米星（ozogamicin）是人源化的抗CD133單抗和細(xì)胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素（calicheamicin）的偶聯(lián)物，用于治療復(fù)發(fā)的急性髓性白血病AML。最近發(fā)現(xiàn)抗CD44的單抗可以消除AML干細(xì)胞[38]。

4 總結(jié)

肺癌干細(xì)胞領(lǐng)域的研究剛剛起步，還有許多問題亟待解決。例如：探尋肺癌干細(xì)胞的具體生物學(xué)特性及其標(biāo)記物、確定腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞間的差別、明確其具體調(diào)控機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。但是，這一理論的提出及認(rèn)定無疑將會是人類攻克肺癌的一大進(jìn)步，可以解釋肺癌的多種生物學(xué)行為，因此結(jié)合腫瘤干細(xì)胞學(xué)說，分析肺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)而闡明肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥的機(jī)制，有助于肺癌的診斷、治療和預(yù)后評估，有助于篩選靶向性殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物，為臨床提供新的治療靶點(diǎn)，將會對肺癌的診斷、治療及預(yù)防產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。