何朗 侯梅 李光明 文世民 楊紅 陳萍 徐聶

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%，其治療和預(yù)后至今仍無(wú)突破性進(jìn)展，故診斷和治療NSCLC一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。剪切修復(fù)偶聯(lián)因子1（Excision-Repair Cross-Complementing 1, ERCC1）是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，也是核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair, NER）途徑的關(guān)鍵基因，它在核酸損傷修復(fù)過(guò)程和凋亡過(guò)程中起著重要作用。蛋白激酶C-α（Protein kinase Calpha, PKCα）是蛋白激酶C（Protein kinase C, PKC）的一種同工酶，是蛋白激酶超家族中的成員，多數(shù)報(bào)道認(rèn)為PKCα所介導(dǎo)的信號(hào)途徑是腫瘤細(xì)胞中一種重要的信號(hào)途徑。本研究采用immunohistochemistry（IHC）分析ERCC1和PKCα在NSCLC組織、癌旁組織中的表達(dá)，以初步探討兩者的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 標(biāo)本來(lái)自于四川大學(xué)華西醫(yī)院住院手術(shù)的51例NSCLC患者的術(shù)后腫瘤標(biāo)本和相應(yīng)的21例癌旁組織標(biāo)本（癌旁肺組織取材距腫瘤邊緣5 cm以上）（2001年1月1日-2002年5月31日），術(shù)前均未行抗腫瘤治療。其病例資料通過(guò)醫(yī)院病案科和隨訪獲取，隨訪率100%。隨訪以病理確診之日起逐月記錄，隨訪5年。

1.2 主要抗體及試劑 鼠抗人ERCC1單克隆抗體（ZMED公司，產(chǎn)品編號(hào)ZM-0138）；鼠抗人PKCα單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，產(chǎn)品編號(hào)Sc-8393）；Sp-9000通用SP Kit免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；第二代即用型免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒（福建邁新生物技術(shù)公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)采用IHC進(jìn)行ERCC1及PKCα的檢測(cè)，預(yù)實(shí)驗(yàn)得出ERCC1最佳IHC方法為兩步法（Elivision，過(guò)夜），枸櫞酸高壓鍋修復(fù)，工作濃度為1:50；PKCα為L(zhǎng)sAB法，EDTA水浴修復(fù)，工作濃度為1:50。ERCC1的陽(yáng)性對(duì)照采用強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)組織扁桃體，著色為細(xì)胞核；PKCα采用結(jié)腸癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，著色為細(xì)胞漿。

1.4 結(jié)果判定 ERCC1呈細(xì)胞核棕黃色顆粒沉著（圖1），參照Wachters[1]的標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野（×400）下隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞核不染色或染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10.0%為陰性（-）；＞10.0%判定為陽(yáng)性（+）。PKCα表現(xiàn)為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒積聚（圖2），參照許良中[2]的標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度分為無(wú)色（0），淡黃（1），棕黃（2），棕褐（3）；染色百分比分為陰性（0），陽(yáng)性細(xì)胞≤10.0%（1），11.0%-50.0%（2），51.0%-75.0%（3），＞75.0%（4）；兩者乘積值為：0-3（-），4-5（+），6-7（++），＞8（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析兩因子間關(guān)系。Ρ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 1 ERCC1在中分化肺鱗癌胞核中的陽(yáng)性表達(dá)（Elivision, ×400）Fig 1 the positive expression of ERCC1 in nucleus of moderately differentiated squamous cell carcinoma of the lung (Elivision, ×400)

圖 2 PKCα在中分化肺鱗癌胞漿中的陽(yáng)性表達(dá)（LsAB, ×400）Fig 2 the positive expression of PKCα in cytoplasm of moderately differentiated squamous cell carcinoma of the lung (LsAB, ×400)

2 結(jié)果

2.1 臨床參數(shù) 51例NSCLC患者年齡為37歲-82歲，中位年齡為60歲。分別參照2003年WHO肺癌的組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)和1997年肺癌的UICC分期標(biāo)準(zhǔn)，其中III期18例（IIIb期患者4例，術(shù)前分期為IIIa期，術(shù)后為IIIb期），IV期5例（包括T3N2M1患者2例與T2N2M1患者1例，為局限性腦轉(zhuǎn)移；余2例患者術(shù)前診斷為IIIa期，術(shù)中發(fā)現(xiàn)另一肺葉內(nèi)存在單個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，術(shù)后病理證實(shí)為IV期）（表1）。

表 1 51例NSCLC患者臨床病理特征Tab 1 the clinical parameter in 51 patients of NSCLC

2.2 ERCC1、PKCα在NSCLC中的表達(dá) NSCLC中ERCC1陽(yáng)性率為58.8%（30/51），癌旁組織中陽(yáng)性率為23.8%（5/21），兩組陽(yáng)性率間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ρ=0.007）。NSCLC中PKCα陽(yáng)性率為74.5%（38/51），癌旁組織陽(yáng)性率為42.9%（9/21），兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ρ=0.010）。ERCC1表達(dá)率證實(shí)與不同的臨床分期、N分期相關(guān)，與性別、年齡、有無(wú)吸煙、組織學(xué)分型、分化程度、T分期和腫瘤部位等臨床病理特征無(wú)關(guān)，臨床III+IV期及N1-2期患者ERCC1表達(dá)率要分別高于I+II期和N0期患者（Ρ=0.011和0.015）。PKCα證實(shí)與臨床各參數(shù)間均無(wú)關(guān)系（Ρ＞0.05）。

2.3 ERCC1、PKCα染色狀態(tài)與術(shù)后5年生存時(shí)間關(guān)系 5年隨訪，生存期＜5年患者為28例，ERCC1陽(yáng)性率為71.4%（20/28）；≥5年患者為23例，ERCC1陽(yáng)性率為43.5%（10/23），χ2檢驗(yàn)證實(shí)ERCC1陰性組5年生存時(shí)間高于陽(yáng)性組（Ρ＜0.05）；而PKCα陽(yáng)性組的5年生存時(shí)間與陰性組比較并沒(méi)有差別（Ρ＞0.05）（表2）。

表 2 ERCC1、 PKCα陽(yáng)性組和陰性組5年生存時(shí)間的比較Tab 2 the relationship about 5 years survival between positive group and negative group of ERCC1/ PKCα in NSCLC

2.4 ERCC1及PKCα之間的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析（秩相關(guān)分析）發(fā)現(xiàn)ERCC1與PKCα之間存在正相關(guān)（r=0.425,Ρ=0.002）。

3 討論

ERCC1是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，在核酸損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要作用，人類的ERCC1基因具有5′-3′核酸內(nèi)切酶的活性，故ERCC1缺乏的細(xì)胞不能進(jìn)行鉑類-DNA加合物的修復(fù)。目前ERCC1與腫瘤的關(guān)系正成為研究的熱點(diǎn)，已有研究[3]證實(shí)它可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我們通過(guò)IHC發(fā)現(xiàn)NSCLC標(biāo)本中ERCC1陽(yáng)性率為58.8%，此結(jié)果與Takenaka[4]關(guān)于NSCLC、Kwon[5]關(guān)于晚期胃癌的IHC結(jié)果類似，我們的發(fā)現(xiàn)支持ERCC1在腫瘤組織中高表達(dá)，提示ERCC1可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

針對(duì)ERCC1與臨床參數(shù)的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)ERCC1在臨床III+IV期及N1-2期患者中高表達(dá)，說(shuō)明ERCC1的陽(yáng)性狀態(tài)可能同腫瘤的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)。而Takenaka[4]證實(shí)ERCC1陽(yáng)性表達(dá)與肺鱗癌關(guān)聯(lián)；Olaussen[6]發(fā)現(xiàn)ERCC1表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類型、胸膜受侵和脈管受侵等明確相關(guān)。從上述結(jié)果可以看出不同的試驗(yàn)得出了不同的結(jié)果，這些差異可能與試驗(yàn)不同的樣本量、樣本來(lái)源以及不同的試驗(yàn)方法有關(guān)，故ERCC1與臨床參數(shù)間的確切關(guān)系尚有待大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以明確。對(duì)于ERCC1與預(yù)后的關(guān)系報(bào)道各異，已證實(shí)ERCC1 mRNA的高表達(dá)預(yù)示卵巢癌患者疾病進(jìn)展的高度風(fēng)險(xiǎn)[7]。而我們的研究結(jié)果與多數(shù)結(jié)論[8,9]類似，支持ERCC1陰性狀態(tài)可能與較好的預(yù)后相關(guān)。但也有不同的結(jié)果，Zheng[10]即認(rèn)為ERCC1高表達(dá)者的生存時(shí)間較長(zhǎng)，故ERCC1與NSCLC之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

PKC是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。PKCα屬于經(jīng)典型PKC[11]，是PKC的一種同工酶。近來(lái)的研究[12]結(jié)果表明，腫瘤組織中PKCα活性明顯增加[12]，其異常表達(dá)和活化能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NSCLC中PKCα陽(yáng)性率為74.5%，在腫瘤組織中高表達(dá)，與Lahu[13]和高志強(qiáng)[14]的研究結(jié)果類似，這提示PKCα可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Byers[15]發(fā)現(xiàn)特異性siRNA靶向敲除ΡKCα基因能夠有效抑制黑素瘤細(xì)胞的遷移，說(shuō)明PKC的效能和表達(dá)水平是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，但我們的結(jié)果卻顯示出PKCα的染色狀態(tài)對(duì)生存并沒(méi)有影響（Ρ＞0.05），我們認(rèn)為尚沒(méi)有依據(jù)支持PKCα的表達(dá)與NSCLC的生存預(yù)后相關(guān)。

ERCC1能夠識(shí)別、切除和修復(fù)損傷DNA片段，缺乏ERCC1的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生DNA修復(fù)缺陷，誘發(fā)細(xì)胞的凋亡反應(yīng)；PKCα與正常細(xì)胞的新陳代謝密切相關(guān)，與腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞凋亡的抑制也有關(guān)。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)這兩種基礎(chǔ)作用機(jī)理不同的檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)合運(yùn)用的報(bào)道，考慮到這兩種指標(biāo)可能具有的一些聯(lián)系，我們初步探索了兩者之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)ERCC1與PKCα之間存在正相關(guān)（Ρ=0.002），分析可能在腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過(guò)程與PKC信號(hào)傳導(dǎo)途徑間存在共同通路，從而產(chǎn)生協(xié)同或相加效應(yīng)，對(duì)該相關(guān)性的進(jìn)一步深入研究，可能會(huì)給NSCLC的治療提供一條新的途徑和一種新的思維。我們的研究表明ERCC1與NSCLC發(fā)生和預(yù)后相關(guān)，且ERCC1與PKCα正相關(guān)，但卻發(fā)現(xiàn)PKCα只與NSCLC的發(fā)生相關(guān)而與其預(yù)后無(wú)關(guān)，這一看似矛盾的結(jié)果可能與不同的實(shí)驗(yàn)方法及我們較小的樣本量有關(guān)，進(jìn)一步大樣本前瞻性研究可能會(huì)更清晰明確兩者在NSCLC中所扮演的角色及相互關(guān)系，因此還需要不斷的探索和驗(yàn)證。