彭金彪，韓宏曉，洪煬，王艷，郭凡吉，石耀軍，傅志強(qiáng)，劉金明，程國(guó)鋒，林矯矯

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241

血吸蟲(chóng) (Schistosome) 感染引起的血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis) 是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)病，目前該病仍在全球74個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，有2億人受感染，6億人受威脅。截止2007年，我國(guó)尚有449個(gè)血吸蟲(chóng)病流行縣 (市、區(qū)) 和3563個(gè)流行鄉(xiāng)鎮(zhèn)，估計(jì)患者50多萬(wàn)人[1]。近年來(lái)我國(guó)加大血吸蟲(chóng)病防治工作力度，血吸蟲(chóng)病流行態(tài)勢(shì)得到有效控制，但是傳染源控制措施很難落實(shí)到位，家畜作為傳染源的威脅依然嚴(yán)峻。目前血吸蟲(chóng)病防治仍以吡喹酮化療為主，但化療可能誘導(dǎo)抗藥性產(chǎn)生，具有潛在產(chǎn)生耐藥性的危險(xiǎn)，且藥物治療無(wú)法控制重復(fù)感染，因此血吸蟲(chóng)病新型疫苗及新藥相關(guān)研究已成為目前血吸蟲(chóng)病防治研究的重大需求。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，利用相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)尋找潛在疫苗候選分子和藥物靶標(biāo)逐漸成為研究的熱點(diǎn)[2]。

日本血吸蟲(chóng)生活史繁雜，經(jīng)過(guò)多個(gè)宿主和不同發(fā)育階段，血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體具有不同的生理病理特征。童蟲(chóng)是血吸蟲(chóng)在終末宿主的早期發(fā)育階段蟲(chóng)體，在血吸蟲(chóng)生生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要意義，童蟲(chóng)蟲(chóng)體脆弱，侵入皮膚內(nèi)早期的血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)是宿主免疫系統(tǒng)攻擊的重要靶標(biāo)，尋找日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)期特異性信號(hào)分子作為疫苗候選分子或藥物靶標(biāo)，以疫苗或藥物阻斷血吸蟲(chóng)的生活史不失為防控血吸蟲(chóng)病的理想途徑[3]。本課題組構(gòu)建的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，為童蟲(chóng)期差異表達(dá)基因的深入系統(tǒng)研究提供了良好的平臺(tái)。CyPB參與的蛋白加工、修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能相關(guān)，在多個(gè)物種中有著廣泛研究[4]。本研究以童蟲(chóng)期高表達(dá)基因 Sj CyPB為研究對(duì)象，克隆、表達(dá)了該基因，驗(yàn)證了該基因在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)期高表達(dá)，同時(shí)評(píng)估該基因重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗血吸蟲(chóng)病的保護(hù)效果，為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和酶

Trizol和superscripTMII反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、SalⅠ、RNA inhibitor、DNAse、熒光實(shí)時(shí)定量PCR (SYBR Green法) 檢測(cè)試劑盒和隨機(jī)引物購(gòu)自TaKaRa生物工程 (大連) 有限公司；DNA Marker DL2000、DL5000，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自上海天根生物科技有限公司；QIAquick?Gel Extraction Kit購(gòu)自 Qiagen公司；Agrose、DEPC購(gòu)自上海生工生物工程公司；硝酸纖維素膜 (Whatman) 購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；Bacto-yeast extract、bacto-tryptone為Oxoid公司產(chǎn)品；GST Bind Resin (Merck-Novagen) 購(gòu)自中新生命科技有限公司；3,3,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 菌種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和血清

感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司，pET28a(+) 表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。新西蘭白兔 (雄性，2.5~3.0 kg) 購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。新西蘭白兔以腹部貼片法分別感染15 000、8000、5 000、2000條血吸蟲(chóng)尾蚴，在感染后7、13、18、23、32、42 d分別剖殺，以肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，用PBS充分洗滌去除粘附的宿主組織后，凍存液氮備用。日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清由本室金亞美老師惠贈(zèng)。

1.3 RNA的提取

取液氮凍存的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)和成蟲(chóng)，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取及純化。

1.4 含ORF cDNA片段擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

從本課題組構(gòu)建的童蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中獲得一段童蟲(chóng)差異表達(dá)EST，長(zhǎng)436 bp，通過(guò)NCBI中Blast分析，發(fā)現(xiàn)該序列與Schistosoma mansoni Cyclophilin B同源。以Schistosoma mansoni Cyclophilin B序列設(shè)計(jì)引物 (上游引物P1和下游引物P2)，以日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA為模板，PCR擴(kuò)增含ORF的cDNA片段序列片段。引物P1(5′?3′)：ATGGCCGTGTTAAG AGTGTT，P2(5′?3′)：TCATTCAGCAGCGTCAGTGT，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。將測(cè)序得到的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì) (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用 DNAStar軟件分析該基因的ORF，并對(duì)其氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量等進(jìn)行分析；利用Clustalw軟件對(duì)不同物種的 CyPB蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；利用GeneDoc軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯。

1.5 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

分別提取日本血吸蟲(chóng)7、13、18、23、32日齡及42日齡的蟲(chóng)體總RNA，定量，反轉(zhuǎn)錄，消化基因組DNA，純化回收。以日本血吸蟲(chóng)NADH基因?yàn)閮?nèi)參，以純化的不同期別的日本血吸蟲(chóng) cDNA為模板，以SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Sj CyPB基因的表達(dá)量。擴(kuò)增Sj CyPB的引物：Sense primer(5′?3′): ATGGCTAATGCTGGTCCTAAC，Antisense primer (5′?3′): GTCCACAGTTTGCTATCTTCAC，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為250 bp左右，引物使用濃度為10 pmol。NADH引物，Sense primer(5′?3′): CGAGGACCTAAC AGCAGAGG，Antisense primer(5′?3′): TCCGAACGA ACTTTGAATCC，引物序列由Dr Goffrey Gobert提供，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度為250 bp左右，引物使用濃度為10 pmol。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Premix Taq 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，EASY Dilution Butter 8.2 μL，模板1 μL；反應(yīng)條件為：95℃10 s，然后95℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，其中72℃ 15 s結(jié)束時(shí)間為熒光信號(hào)檢測(cè)點(diǎn)，每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)。采用cobert公司rotogene6.0軟件進(jìn)行計(jì)算分析，以NADH作為內(nèi)參，得出相對(duì)于每百萬(wàn)持家基因的目的基因含量。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

1.6.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

在該基因ORF擴(kuò)增序列的5′端和3′端分別引入EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到含完整ORF的Sj CyPB基因序列，將該序列定向亞克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-Sj CyPB。

1.6.2 在大腸桿菌中的表達(dá)

將以PCR、酶切和測(cè)序3種方法鑒定為陽(yáng)性的pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600=1.0時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)分別收集菌液，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間和相關(guān)誘導(dǎo)表達(dá)條件；同時(shí)以SDS-PAGE電泳分析經(jīng)超聲波裂解后的菌體蛋白，判定其表達(dá)狀況。將以包涵體形式存在的重組蛋白溶解于8 mol/L尿素，然后以濃度梯度降低的溶解尿素的PBS逐漸透析至PBS中，完成復(fù)性，隨后以GST Bind Resin純化出重組蛋白。

1.6.3 Western blotting檢測(cè)

將純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC) 膜上，用經(jīng)pGEX-6P-1/BL21空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌蛋白吸附的日本血吸蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原免疫兔血清作一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，以沉淀型TMB作為底物進(jìn)行顯色。

1.7 小鼠免疫保護(hù)性試驗(yàn)

1.7.1 動(dòng)物分組

選擇6~8周齡 (SPF級(jí)) BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為免疫組、佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組。免疫組每次每只注射含206佐劑和20 μg純化的Sj CyPB重組蛋白的乳化液；佐劑對(duì)照組每次每只注射相同體積的206佐劑和PBS的乳化液；空白對(duì)照組每次每只注射相同體積的 PBS。免疫間隔時(shí)間為2周，共免疫3次。第3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染 (30±2) 條日本血吸蟲(chóng)尾蚴。

1.7.2 蟲(chóng)體計(jì)數(shù)

攻蟲(chóng)42 d后，剖殺小鼠，收集血清，以肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，計(jì)數(shù)蟲(chóng)體，計(jì)算減蟲(chóng)率。

1.7.3 肝組織蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)

解剖小鼠時(shí)采集肝臟，稱(chēng)取1 g，加入5 mL PBS，用勻漿機(jī)混勻后，加入5 mL 10% NaOH (W/V)，56℃水浴鍋中消化2 h，消化完全后混勻取4份50 μL樣品，鏡檢計(jì)算蟲(chóng)卵數(shù) (EPG為平均每克肝組織中蟲(chóng)卵數(shù))，計(jì)算減卵率[5]。

1.7.4 ELISA檢測(cè)抗體水平

試驗(yàn)小鼠分別于免疫前、一免、二免和三免后第7天尾部采血，剖殺時(shí)收集血液分離血清，1∶100稀釋后按常規(guī)ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)[6]。

1.7.5 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Duncan法)。

2 結(jié)果

2.1 Sj CyPB基因的克隆及生物信息學(xué)分析

在本課題組構(gòu)建的童蟲(chóng)文庫(kù)中篩選得到日本血吸蟲(chóng)Sj CyPB基因，核苷酸和氨基酸序列分析比較結(jié)果顯示：該序列編碼的氨基酸與曼氏血吸蟲(chóng)CyPB具有較高相似性，同時(shí)具有典型的CyP家族功能結(jié)構(gòu)域，故命名為日本血吸蟲(chóng)Cyclophilin B基因 (Sj CyPB)，將該基因序列提交到 NCBI，登錄號(hào)為GQ403665。

以日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)cDNA為模板，PCR克隆獲得含完整開(kāi)放閱讀框的編碼基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?72 bp (圖1)。分析表明，該基因編碼243 個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白分子量為23.5 kDa。選擇分別來(lái)自曼氏血吸蟲(chóng)、果蠅、雞、硬蜱、爪蟾、斑馬魚(yú)、小鼠、牛、人、秀麗桿線(xiàn)蟲(chóng)、球蟲(chóng)、家蠶、馬來(lái)絲蟲(chóng)、?？㈠F蟲(chóng)15個(gè)物種的CyPB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示：該基因所編碼氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)的CyPB相似性為84℅，與CyPB其他物種相似性在54%~64℅之間。這也與CyPB基因在不同物種中較為保守，其遺傳距離遠(yuǎn)近與物種的遺傳距離遠(yuǎn)近基本吻合。

2.2 Sj CyPB基因的期別差異表達(dá)分析

Real-time PCR分析結(jié)果表明，Sj CyPB在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)和成蟲(chóng)中均有較高表達(dá) (圖 2)，其中以18 d童蟲(chóng)基因表達(dá)量最高，7 d童蟲(chóng)的基因表達(dá)量相對(duì)較低 (圖2)。

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-6P-1-Sj CyPB/ BL21的構(gòu)建與原核表達(dá)及蛋白純化

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 PCR products of Sj CyPB gene. M: DL2000 DNA ladder; A: PCR products of Sj CyPB gene.

圖2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析Sj CyPB基因在日本血吸蟲(chóng)不同階段蟲(chóng)體的表達(dá)情況Fig. 2 Stage differential expression of Sj CyPB in different stages of Schistosoma japonicum by real-time PCR. 7 d: 7 days schistosomula; 13 d: 13 days schistosomula; 18 d: 18 days schistosomula; 23 d: 23 days worms; 32 d: 32 days worms; 42 d: 42 days adult worms.

經(jīng)PCR、雙酶切鑒定和測(cè)序，證實(shí)pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21在大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)，重組蛋白分子量約為49.5 kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。改變誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間以?xún)?yōu)化表達(dá)條件，結(jié)果顯示終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，蛋白達(dá)到最大表達(dá)量?？扇苄苑治鲲@示：重組蛋白以包涵體形式存在 (圖3)。將重組蛋白溶解于8 mol/L尿素，以尿素濃度梯度降低的PBS逐漸透析至PBS中。完成復(fù)性，經(jīng)過(guò)GST Bind Resin純化重組蛋白 (圖4)。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析

表達(dá)的重組蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用經(jīng)pGEX-6P-1/BL21載體和大腸桿菌菌體蛋白吸附的日本血吸蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原免疫兔血清作一抗，Western blotting檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一明顯的識(shí)別條帶，大小與已知目的條帶一致 (圖5)，表明重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。

圖3 SDS-PAGE分析pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組蛋白的表達(dá)Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression products of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli. M: low-molecular protein marker; A: pGEX-6P-1 uninduced with IPTG for 6 h; B: pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 induced with 1 mmol/L IPTG.

圖4 SDS-PAGE分析pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21純化的重組蛋白Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli. M: low-molecular protein marker; A&B: purified recombinant protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 in E. coli.

2.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 (表 1) 表明空白對(duì)照組平均每只小鼠載蟲(chóng)數(shù)為21.9條，佐劑對(duì)照組為20.91條，而免疫組為 15.0條，與空白對(duì)照組相比，重組蛋白Sj CyPB在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)了31.50%的減蟲(chóng)率，t檢驗(yàn)分析表明免疫組和空白對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)；與佐劑對(duì)照組相比，重組蛋白 Sj CyPB在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)了28.26%的減蟲(chóng)率，t檢驗(yàn)分析表明免疫組和佐劑對(duì)照組差異顯著 (P＜0.05)。肝臟經(jīng)消化處理后，顯微鏡下進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)，空白對(duì)照組平均每克小鼠肝臟蟲(chóng)卵數(shù)為70.768個(gè)，佐劑對(duì)照組為69.866個(gè)，而免疫組為41740.7個(gè)，與空白對(duì)照組相比，肝臟蟲(chóng)卵數(shù)減少41.01%，t檢驗(yàn)分析顯示差異極顯著 (P＜0.01)；與佐劑對(duì)照組相比，肝臟蟲(chóng)卵數(shù)減少40.25%，t檢驗(yàn)分析顯示差異顯著(P＜0.05) (表1)。

2.6 血清抗體水平

各組小鼠血清中Sj CyPB特異性IgG抗體的變化見(jiàn)圖6。第2次免疫后7 d重組抗原免疫組的抗Sj CyPB特異性IgG抗體滴度達(dá)到較高水平，三免后又略有升高，攻蟲(chóng)6 周后剖殺動(dòng)物時(shí)抗體水平達(dá)到更高水平，而空白對(duì)照組和佐劑對(duì)照組Sj CyPB特異性 IgG抗體水平在攻擊前后一直維持在較低水平，無(wú)明顯變化 (圖6)。

圖5 pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21重組蛋白的 Western blotting分析Fig. 5 Western blotting analysis of Sj CyPB recombinant protein. M: protein marker; A: protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 induced with IPTG; B: purified protein of pGEX-6P-1-Sj CyPB/BL21 uninduced with IPTG.

表1 BALB/c小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Tab1e 1 Worm and egg counting reduction rate induced by Sj CyPB in Balb/c mice

圖6 Balb/c小鼠血清抗Sj CyPB抗原特異性IgG抗體水平檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Specific IgG level against Sj CyPB by ELISA.

3 討論

血吸蟲(chóng)生活史繁雜，血吸蟲(chóng)在生活史不同階段的個(gè)體形態(tài)、發(fā)育等有著很大差異，就其原因，可能源于日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)水平差異。信號(hào)通路相關(guān)分子在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，加強(qiáng)日本血吸蟲(chóng)信號(hào)分子的研究，可為研究寄生蟲(chóng)與宿主相互作用關(guān)系和高效的抗日本血吸蟲(chóng)疫苗提供基礎(chǔ)[7-8]。

Cyclophilin (CyP) 廣泛存在，在不同物種中較為保守。CyP可結(jié)合相關(guān)蛋白，并催化加速其折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)；特別是可催化富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，起著分子伴侶的作用；同時(shí)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要調(diào)節(jié)作用[9]。本研究克隆的Sj CyPB基因?yàn)镃yP家族的主要成員，CyPB存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也存在于高爾基復(fù)合體、細(xì)胞表面和基質(zhì)中，研究表明其在多個(gè)物種生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，包括加速蛋白結(jié)合及輔助折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)的功能等[10-11]，但在血吸蟲(chóng)中未見(jiàn)有對(duì)其功能的詳細(xì)研究報(bào)道。

本研究以Sj CyPB為研究對(duì)象，克隆了該基因，將其序列與Sm CyPB比對(duì)，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)該基因所編碼氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)編碼氨基酸序列的相似性為84℅，與其余物種CyPB基因的相似性在54%~64℅之間。該基因編碼氨基酸序列與日本血吸蟲(chóng)終末宿主如人、牛 CyPB的編碼氨基酸序列差異較大，說(shuō)明有作為潛在疫苗候選分子何藥物靶標(biāo)進(jìn)行深入研究的可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)，Sj CyPB在日本血吸蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育階段發(fā)育中均有表達(dá)，其中以18 d童蟲(chóng)基因表達(dá)量最高，7 d童蟲(chóng)的基因表達(dá)量相對(duì)較低。18 d童蟲(chóng)及隨后階段蟲(chóng)體在終末宿主體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育較快，代謝旺盛，蟲(chóng)體細(xì)胞分化迅速，CyPB基因在該階段的大量表達(dá)，可能與 CyPB參與的蛋白加工、修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能相關(guān)，CyPB基因可能在日本血吸蟲(chóng)生活和生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要的生物學(xué)意義。

本研究以日本血吸蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原免疫兔血清作為一抗，Western blotting證實(shí)Sj CyPB重組蛋白具有良好的免疫原性。以Sj CyPB重組抗原進(jìn)行小鼠抗原免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明Sj CyPB重組抗原在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生部分免疫保護(hù)效果，小鼠成蟲(chóng)荷蟲(chóng)量減少了31.5%，肝臟蟲(chóng)卵數(shù)減少了41.01%。以上研究表明，Sj CyPB基因可作為潛在的日本血吸蟲(chóng)疫苗候選分子深入研究。同時(shí)，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)了試驗(yàn)鼠Sj CyPB重組抗原特異性IgG抗體消長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示重組抗原免疫小鼠產(chǎn)生了特異性 IgG抗體，而空白對(duì)照組和佐劑對(duì)照組特異性IgG抗體水平一直維持在較低水平，基本上沒(méi)有變化，提示Sj CyPB重組抗原免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答可能在抗血吸蟲(chóng)感染中發(fā)揮一定的作用。

本研究克隆了日本血吸蟲(chóng)Sj CyPB基因，分析Sj CyPB在日本血吸蟲(chóng)不同期別的表達(dá)情況，隨后在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該基因重組抗原可在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用?？傊狙芯繉?duì)Sj CyPB基因進(jìn)行了初步研究，該基因在血吸蟲(chóng)性別發(fā)育中的生物學(xué)功能以及其作為抗血吸蟲(chóng)病候選疫苗或藥物靶標(biāo)的潛力仍需進(jìn)一步深入研究。

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