謝立，官月平，戈瑩，時(shí)洪波

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069

2 北京科技大學(xué)，北京 100083

丙型肝炎病毒抗原 (HCAg) 是丙型肝炎病毒(HCV) 早期感染的特異性抗原，是診斷 HCV早期感染的有效指標(biāo)[1]。目前國(guó)內(nèi)還沒有 HCAg的臨床檢測(cè)試劑[2]。在前期的研究工作中已用酶聯(lián)免疫吸附分析法 (ELISA) 對(duì)HCAg進(jìn)行了初步檢測(cè)[3]，在該方法中丙肝抗體 (抗-HCV) 通過簡(jiǎn)單的物理吸附固定在聚苯乙烯酶標(biāo)板上。有人認(rèn)為聚苯乙烯酶標(biāo)板吸附抗原的效果優(yōu)于吸附抗體的效果；經(jīng)過ELISA實(shí)驗(yàn)過程中多次洗滌，聚苯乙烯酶標(biāo)板吸附的蛋白質(zhì)不斷解吸附而使其濃度愈來愈低；而且適用于某種抗原-抗體系統(tǒng)的聚苯乙烯酶標(biāo)板，對(duì)另一抗原-抗體系統(tǒng)未必是最合適的[4]。

為此，本研究室正在進(jìn)一步研究建立新的HCAg磁性免疫檢測(cè)系統(tǒng)，而固相載體的選擇和修飾方法是建立這種新的檢測(cè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。本研究旨在探討玻璃載體表面修飾方法對(duì)抗-HCV偶聯(lián)效率和免疫活性的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

純化 HCV基因工程表達(dá) NS3抗原 (HCAg-NS3) (原中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所)，戊二醛、硼氫化鈉 NaBH4、辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (Sigma公司)，牛血清白蛋白BSA (Roche公司)，HRP標(biāo)記丙肝 NS3單克隆抗體(McAb) (本研究室)，其余試劑 (國(guó)產(chǎn)，分析純)，酶標(biāo)儀Model 680 (BIO-RAD公司)，紫外分光光度計(jì)UV-2550 (日本島津)。

1.2 抗-HCV McAb的制備

按常規(guī)方法制備抗-HCV McAb[5]，用飽和硫酸銨法進(jìn)行純化。

1.2.1 SiO2載體的硅烷化

市售普通玻璃試管用鉻酸洗液浸泡過夜，Milli-Q水清洗，加入氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)水溶液 (pH 5~6)，80℃振蕩反應(yīng)，水清洗后再用無水乙醇清洗。

1.2.2 SiO2載體的醛基化

在已硅烷化的玻璃試管中加入 3% (V/V) 的戊二醛水溶液，室溫振蕩反應(yīng)，用水清洗。

1.2.3 SiO2載體與抗-HCV McAb的偶聯(lián)

在已醛基化的玻璃試管中加入不同濃度的抗-HCV McAb溶液，37℃振蕩反應(yīng)2 h，水洗4~5次后，加入濃度為2 g/L的BSA封閉液，4℃反應(yīng)過夜，用水清洗。

1.2.4 抗-HCV McAb偶聯(lián)效率的吸光度測(cè)定

以稀釋抗-HCV McAb的緩沖液1×PBS為空白，在280 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定抗-HCV McAb與玻璃偶聯(lián)前、后的吸光度值OD值。

1.2.5 抗-HCV McAb偶聯(lián)效率的免疫測(cè)定

在已偶聯(lián)抗-HCV McAb的玻璃試管中加入工作濃度的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37℃反應(yīng)30 min，0.02 mol/L PBST洗4~5次，TMB底物顯色，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以未偶聯(lián)抗-HCV McAb的玻璃試管為陰性對(duì)照。

1.2.6 HCAg的測(cè)定

在已偶聯(lián)抗-HCV McAb的玻璃試管中加入不同濃度的HCAg，以10% BSA溶液為陰性對(duì)照，37℃反應(yīng)1 h，0.02 mol/L PBST充分洗滌后，加入工作濃度為1∶2000的HRP標(biāo)記抗-HCV McAb，37℃反應(yīng)30 min，0.02 mol/L PBST洗4~5次，TMB底物顯色，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。加入HCAg試管的OD值與陰性對(duì)照管OD值之比大于等于2.1時(shí)判定為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，差異的顯著性用多元回歸分析的F檢驗(yàn)和相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用于偶聯(lián)玻璃試管的抗-HCV McAb純化后蛋白濃度為9.66 g/L，間接ELISA法測(cè)定效價(jià)為1∶30萬。

2.1 SiO2載體制備方法對(duì)抗-HCV McAb偶聯(lián)效率的影響

玻璃醛基化及蛋白質(zhì)固定過程包括表面氨基化、醛基化、蛋白質(zhì)的偶聯(lián)及還原等步驟 (圖 1)，本研究主要討論醛基化的優(yōu)化過程。

圖1 抗-HCV McAb固定到玻璃上的化學(xué)過程Fig. 1 Chemical process of anti-HCV McAb immobilized onto glass.

2.2 氨基硅烷濃度和反應(yīng)時(shí)間的影響

抗-HCV McAb的偶聯(lián)效率受氨基硅烷的濃度和反應(yīng)時(shí)間雙因素影響，多元回歸分析得到F=34.92，P＜0.05，故總體上認(rèn)為氨基硅烷的濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)抗-HCV McAb的偶聯(lián)效率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表中可以看出，10% (V/V) 氨基硅烷水溶液處理3 h有最佳的效果 (表1)。

2.3 醛基化時(shí)間的選擇

用不同醛基化時(shí)間處理的玻璃試管進(jìn)行抗-HCV McAb偶聯(lián)效率的免疫測(cè)定，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (r=0.912，P＜0.01)，醛基化時(shí)間為2~ 3 h，抗-HCV McAb有較高的偶聯(lián)效率 (圖 2)。

2.4 不同濃度抗-HCV McAb的偶聯(lián)效率測(cè)定

表2數(shù)據(jù)顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (r=0.945，P＜0.01)，抗-HCV McAb濃度增加，偶聯(lián)效率提高，在后續(xù)研究實(shí)驗(yàn)中，選擇抗-HCV McAb濃度為8 mg/L作為與玻璃偶聯(lián)的濃度。

2.5 抗-HCV McAb不同偶聯(lián)時(shí)間的偶聯(lián)效率測(cè)定

從表 3可知，差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯(r=0.676，P＞0.05)，在抗-HCV McAb濃度為8 mg/L時(shí)，隨著抗-HCV McAb偶聯(lián)時(shí)間增加，偶聯(lián)效率提高不明顯，所以選擇3 h為抗-HCV McAb的最佳偶聯(lián)時(shí)間。

表1 氨基硅烷濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)抗-HCV McAb偶聯(lián)量的影響Table 1 Effect of aminosilane concentration and treatment time on anti-HCV McAb assay

圖2 醛基化時(shí)間對(duì)抗-HCV McAb偶聯(lián)效率的影響Fig. 2 Anti-HCV McAb immobilization efficiency with different glutaraldehyde treatment time. The concentration of HCV McAb in the fig was 10 mg/L, as described previously[3]. The immobilization time in the fig was overnight, as described previously[3].

表2 抗-HCV McAb濃度對(duì)偶聯(lián)效率的影響Table 2 Effect of anti-HCV McAb concentration on immobilization efficiency

表3 抗-HCV McAb偶聯(lián)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響Table 3 Effect of immobilization time on immobilization efficiency

2.6 HCAg的測(cè)定

在 HCAg測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，HRP標(biāo)記的抗-HCV McAb與玻璃試管上偶聯(lián)的抗-HCV McAb分別識(shí)別不同的HCAg抗原表位，形成有效的夾心模式檢測(cè)HCAg，測(cè)定結(jié)果顯示可檢測(cè)HCAg至1 μg/L。

3 討論

固相載體的質(zhì)量直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果，有多種不同的方法用于抗體在固相載體表面的固定[6]。目前，大多數(shù)用于臨床診斷的生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法主要為酶免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、熒光免疫分析等，在這些傳統(tǒng)方法中，蛋白質(zhì)通過疏水性物理作用微弱地吸附于固相表面，固定得不牢固，且容易影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性。

在蛋白質(zhì)固定過程中，固相支持物的選擇和處理是很重要的一步，它不但要對(duì)蛋白質(zhì)有較高的固定能力，而且還要保證固定在其表面的蛋白質(zhì)保持活性[7]。玻璃具有廉價(jià)、表面光滑不滲透、背景低等優(yōu)點(diǎn)，目前大多數(shù)蛋白芯片均以此作為固相載體[8]，通過化學(xué)交聯(lián)法制得的固相蛋白質(zhì)吸附容量大，蛋白質(zhì)分子之間相互制約，吸附牢固，能夠耐受多次洗滌，具有較高的反應(yīng)活性[9]。本研究實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)交聯(lián)劑是戊二醛，它是目前最常用的同型雙官能團(tuán)化合物，其兩端的醛基可與硅烷化的玻璃和蛋白質(zhì)的游離氨基形成shiff堿，從而完成蛋白質(zhì)在玻璃表面的固定。但是戊二醛本身能使蛋白質(zhì)中毒，所以根據(jù)費(fèi)嘉等[10]的報(bào)道選擇 3% (V/V)的戊二醛水溶液進(jìn)行反應(yīng)。

Kusnezow 等[11]通過對(duì)丙基三甲氧基硅烷和多聚賴氨酸等修飾的玻片進(jìn)行比較，結(jié)果顯示前者最好，但是在玻璃硅烷化過程中發(fā)現(xiàn)，氨基硅烷的濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)非特異反應(yīng)有較大影響，可能是高濃度的氨基硅烷較長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)后吸附或固定到玻璃表面上所致。

為了減少測(cè)定過程中的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)固定后還應(yīng)進(jìn)行封閉，一般選用末端具有一個(gè)或多個(gè)羧基的封閉劑，在本研究實(shí)驗(yàn)中選用濃度為 2%的BSA有較好的封閉效果。

總之，本研究中用于在玻璃上固定抗體的反應(yīng)條件溫和，可在4℃~40℃及pH 6.0~8.0內(nèi)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜；由于本研究應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)劑固定抗體，即抗體以共價(jià)鍵方式固定在載體表面，而前期研究工作中用ELISA方法測(cè)定HCAg時(shí)，抗體以物理吸附方式固定在載體表面，所以前者有較大量的固相蛋白參與后續(xù)反應(yīng)，因而對(duì)HCAg檢測(cè)有更高的靈敏度 (ELISA法的靈敏度大于2 μg/L)，為進(jìn)一步用超順磁性納米微球進(jìn)行高靈敏度、高特異性的HCV患者血清中痕量HCAg檢測(cè)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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