吳則東，王華忠，韓 英

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080））

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年因生產(chǎn)銷售假劣種子造成的坑農(nóng)害農(nóng)事件時有發(fā)生，給種子使用者造成減產(chǎn)或不可挽回的經(jīng)濟損失，給種子經(jīng)營者和國家造成較大的負面影響。因此種子純度鑒定就成為正確評定種子等級的主要依據(jù)。種子純度鑒定是種子檢驗的中心，是對一批種子中個體與個體之間在特征特性方面典型一致性程度的檢驗和種子真實性的鑒定。世界各國都對種子的純度鑒定給予高度的重視，而我國從2000年12月1日起開始實施《中華人民共和國種子法》，該法的實施對我國的種子生產(chǎn)經(jīng)營者是一件具有歷史意義的大事，使我國的種子生產(chǎn)經(jīng)營有法可依，也為種子糾紛案件提供了法律依據(jù)，但是這一切都要以科學(xué)的種子純度鑒定工作為依據(jù)。而種子純度鑒定工作是一項復(fù)雜的工作，它涉及生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等多方面的知識，而研究領(lǐng)域也從宏觀發(fā)展到微觀。本文主要對近些年來農(nóng)作物種子主要的純度鑒定方法作一綜述，并提出未來甜菜種子純度鑒定的發(fā)展方向。

1 種子純度鑒定的常用方法

1.1 田間小區(qū)種植鑒定法

該方法是中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程GB/T3543.5-1995規(guī)定的鑒定程序，是鑒定品種真實性和測定品種純度的最為可靠、準(zhǔn)確的方法。該方法能夠觀察、比較的性狀較多，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。是目前解決種子質(zhì)量糾紛中最具有法律效力的檢測方法。為使鑒定品種的特征特性充分表現(xiàn)，試驗田要選擇氣候環(huán)境適宜、土壤肥力中等、肥力均勻，并有適宜的栽培管理措施的田塊。小區(qū)設(shè)計采用符合田間統(tǒng)計要求的隨機小區(qū)設(shè)計，設(shè)重復(fù)，設(shè)對照。種植時鑒定品種和對照標(biāo)準(zhǔn)品種要盡量在同一田塊，株行距可適當(dāng)增加。要保持品種的差異和品種的特征特性，要求不能間苗。盡量少用除草劑及植物生長調(diào)節(jié)劑。在植株的不同發(fā)育時期與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比較對照，主要根據(jù)株形、株高、葉片數(shù)、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等做出評判，從而對不同品種加以鑒別。田間小區(qū)種植鑒定方式多種多樣，可在當(dāng)?shù)赝?、?dāng)?shù)禺惣净虍惖禺惣痉N植鑒定。但該方法鑒定費工、費時且周期長，對鑒定人員、種植田塊及田間管理要求較高。要求田間種植小區(qū)需要具有能使鑒定性狀正常生長發(fā)育的氣候、土壤及栽培條件，并對病蟲害有相對的防護措施；要求鑒定人員具有豐富的經(jīng)驗，熟練掌握鑒定品種的特征特性，才能正確鑒別。

1.2 同工酶電泳技術(shù)

酶是生物代謝中的一種特殊蛋白質(zhì)，同工酶是指同一生物體或同一組織中催化相同化學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)不同的一類酶。其結(jié)構(gòu)的差異來源于基因型的差異。在作物種子純度鑒定中，常用的是多態(tài)性較強的脂酶和過氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。這種電泳利用電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和不連續(xù)系統(tǒng)的濃縮效應(yīng)，將蛋白質(zhì)或由蛋白質(zhì)組成的同工酶進行分離。該法分辨率高，不易與樣品相互作用，具有熱穩(wěn)定、無色透明、純度高等優(yōu)點。因此是目前種子純度鑒定中研究較多、應(yīng)用較廣的電泳方法。目前已經(jīng)應(yīng)用此法對向日葵[1]、玉米[2]、甜椒[3]等品種進行純度鑒定。該方法在使用過程中對酶的提取和電泳條件要求嚴(yán)格，如分離膠的濃度、濃縮膠的高度、催化劑的濃度及用量、溫度等等都對電泳的最終結(jié)果產(chǎn)生影響，某些同工酶的種類易隨生活力和發(fā)育進程的變化而變化，從而對種子純度鑒定產(chǎn)生不利的影響，因此需要不斷的實驗，找到適合某一作物的最好條件。

1.3 蛋白質(zhì)電泳法

蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是從種子中提取蛋白質(zhì)，在某些方面彌補了同工酶電泳的缺點。蛋白質(zhì)的提取容易且無需低溫條件，縮短了周期；蛋白質(zhì)成分數(shù)量穩(wěn)定，不受外界環(huán)境條件的影響。目前該方法在小麥種子酸溶蛋白和玉米種子鹽溶蛋白的應(yīng)用中比較多，效果也比較好。

1.4 DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)

通過對品種DNA的多態(tài)性即DNA堿基序列的差異進行分析，從而鑒別不同品種。該方法檢測對象是品種的 DNA片段（基因），沒有器官的特異性，在植物體的各個組織、各個發(fā)育時期均可檢測；不受環(huán)境的影響，因DNA分子標(biāo)記的數(shù)量極多，遍及整個基因組，這是同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)所無法比擬的；完全遵守簡單的孟德爾遺傳方式，并具有體細胞穩(wěn)定性。目前DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)主要有以下幾個方面。

1.4.1 RFLP 作為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記，RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DNA片段→把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上→利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。RFLP反映了DNA序列中核酸排列順序的差異性。一個物種的DNA在限制性內(nèi)切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基突變、結(jié)構(gòu)重排（包括缺失、重復(fù)、易位和插入）以及甲基化等，均可導(dǎo)致限制性片段長度的多態(tài)性。理論上講，每一個品種就是一種基因型，通過分析大多可以找到相對應(yīng)的RFLP指紋圖譜，利用這個RFLP指紋圖譜就可將這個品種與其它品種或混雜株區(qū)分開來。但該方法更費時、費力，需要進行DNA多種酶切、轉(zhuǎn)膜以及探針的制備等多個步驟，檢測周期長，成本高，還要用到放射性元素，因此在品種純度鑒定應(yīng)用上受到一定的影響，目前已經(jīng)很少使用。

1.4.2 RAPD 該技術(shù)是1990年發(fā)明并發(fā)展起來的，RAPD是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基礎(chǔ)之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物的品種鑒定上。但RAPD技術(shù)對反應(yīng)條件十分敏感，因此RAPD標(biāo)記檢測作物種子純度時，必須使RAPD反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化、程序化，這包括DNA的提取、RAPD反應(yīng)混合物中各成分的濃度、電泳條件、溴化乙錠染色等；另外還必須建立每種作物品種種子純度的RAPD檢測技術(shù)操作規(guī)程，這樣RAPD檢測結(jié)果才可靠、準(zhǔn)確。目前RAPD方法鑒定種子純度已經(jīng)在油菜[4]、西瓜[5]、南瓜[6]、水稻[7]等作物上進行了應(yīng)用，取得了很好的效果。

1.4.3 AFLP 該技術(shù)是基于PCR技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結(jié)合位點。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。AFLP具有分析所需 DNA量少、可重復(fù)性好、多態(tài)性強、分辨率高、不需要 Southern雜交以及無放射性危害等特點。但是由于AFLP技術(shù)是一種專利技術(shù)，受專利保護，而且試劑盒價格昂貴，很難進行批量鑒定，操作過程較為復(fù)雜，對操作人員技術(shù)要求高，并且對DNA提取純度和內(nèi)切酶質(zhì)量要求嚴(yán)格，一般人較難掌握，使其應(yīng)用受到一定的限制。目前應(yīng)用AFLP已經(jīng)成功地鑒定了茶樹[8]、白菜[8]及瓠瓜[10]等等。

1.4.4 SSR 該技術(shù)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp，其中最常見是雙核酸重復(fù)，即（CA）n和（TG）n，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同，通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)染色帶的差異來進行純度鑒定。SSR具有以下一些優(yōu)點：（1）復(fù)性溫度高，擴增重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠；（2）微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，符合孟德爾遺傳規(guī)律。故可鑒別雜合子和純合子，對個體鑒定具有特殊意義；（3）SSR標(biāo)記技術(shù)所需的DNA量少，僅需要微量組織。即便DNA降解，其亦能有效分析鑒別。因此目前應(yīng)用SSR技術(shù)鑒定品種純度應(yīng)用比較廣泛，如黃瓜[11]、馬鈴薯[12]、大豆[13]、水稻[14]等等。

1.4.5 SRAP 是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，該標(biāo)記通過獨特的雙引物設(shè)計對基因的ORFs（Open reading frames）的特定區(qū)域進行擴增，上游引物長17bp，對外顯子區(qū)域進行特異擴增。下游引物長18bp，對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增。因不同個體以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡便、高效、產(chǎn)率高、共顯性高、重復(fù)性好、易測序、便于克隆目標(biāo)片段的特點。目前SRAP技術(shù)在西瓜[15]、水稻[16]及花生[17]等作物的純度鑒定上已經(jīng)取得了一定的成果。

2 甜菜種子純度鑒定的常用方法

目前甜菜種子純度鑒定的微觀方法還沒有開展，對甜菜種子純度鑒定方法通常采取田間小區(qū)種植法。如2008年10月，新疆伊犁州種子檢測中心，首次開展了KWS9103甜菜種子真實性和品種純度種植鑒定。以進口的KWS9103做對照，并進行了認真細致的田間記錄和管理，保證了鑒定田植株長勢良好。同時在甜菜幼苗期和成長期進行了鑒定。證明此方法可行。

3 甜菜種子純度鑒定方法的展望

無論是田間鑒定技術(shù)還是生化鑒定技術(shù)，由于其鑒定的標(biāo)記數(shù)有限，不能滿足種子純度和種質(zhì)資源鑒定及育種工作的發(fā)展需要。目前國家加大了甜菜產(chǎn)業(yè)的投入，實施了甜菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)，隨著甜菜產(chǎn)業(yè)的繁榮，建立一套行之有效的甜菜種子純度鑒定方法尤為重要，而甜菜基因組DNA的快速提取方法已經(jīng)建立，相應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)如RFLP、RAPD、SRAP、SSR等也已經(jīng)應(yīng)用成功，而SSR和SRAP具有信息含量高、遺傳釋義明確、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點，在品種真實性及種子純度鑒定中具有良好的應(yīng)用前景。而目前已經(jīng)有數(shù)十個甜菜SSR位點被發(fā)現(xiàn)，SRAP引物更是多達上百對，因此在不久的將來，可望構(gòu)建完全由SSR標(biāo)記或SRAP標(biāo)記組成的基因組圖譜，建立DNA圖譜檔案和品種特有的DNA數(shù)據(jù)庫；同時降低實驗成本，使質(zhì)檢部門易于接受以及更加簡化種子DNA提取程序。進一步推動SSR及SRAP標(biāo)記在甜菜種子純度鑒定中的應(yīng)用，不久的將來會直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為甜菜種子糾紛仲裁作出科學(xué)的判斷。

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