吳則東，王華忠，韓 英

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080））

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年因生產(chǎn)銷售假劣種子造成的坑農(nóng)害農(nóng)事件時(shí)有發(fā)生，給種子使用者造成減產(chǎn)或不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失，給種子經(jīng)營(yíng)者和國(guó)家造成較大的負(fù)面影響。因此種子純度鑒定就成為正確評(píng)定種子等級(jí)的主要依據(jù)。種子純度鑒定是種子檢驗(yàn)的中心，是對(duì)一批種子中個(gè)體與個(gè)體之間在特征特性方面典型一致性程度的檢驗(yàn)和種子真實(shí)性的鑒定。世界各國(guó)都對(duì)種子的純度鑒定給予高度的重視，而我國(guó)從2000年12月1日起開(kāi)始實(shí)施《中華人民共和國(guó)種子法》，該法的實(shí)施對(duì)我國(guó)的種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者是一件具有歷史意義的大事，使我國(guó)的種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)有法可依，也為種子糾紛案件提供了法律依據(jù)，但是這一切都要以科學(xué)的種子純度鑒定工作為依據(jù)。而種子純度鑒定工作是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，它涉及生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等多方面的知識(shí)，而研究領(lǐng)域也從宏觀發(fā)展到微觀。本文主要對(duì)近些年來(lái)農(nóng)作物種子主要的純度鑒定方法作一綜述，并提出未來(lái)甜菜種子純度鑒定的發(fā)展方向。

1 種子純度鑒定的常用方法

1.1 田間小區(qū)種植鑒定法

該方法是中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T3543.5-1995規(guī)定的鑒定程序，是鑒定品種真實(shí)性和測(cè)定品種純度的最為可靠、準(zhǔn)確的方法。該方法能夠觀察、比較的性狀較多，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。是目前解決種子質(zhì)量糾紛中最具有法律效力的檢測(cè)方法。為使鑒定品種的特征特性充分表現(xiàn)，試驗(yàn)田要選擇氣候環(huán)境適宜、土壤肥力中等、肥力均勻，并有適宜的栽培管理措施的田塊。小區(qū)設(shè)計(jì)采用符合田間統(tǒng)計(jì)要求的隨機(jī)小區(qū)設(shè)計(jì)，設(shè)重復(fù)，設(shè)對(duì)照。種植時(shí)鑒定品種和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品種要盡量在同一田塊，株行距可適當(dāng)增加。要保持品種的差異和品種的特征特性，要求不能間苗。盡量少用除草劑及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在植株的不同發(fā)育時(shí)期與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較對(duì)照，主要根據(jù)株形、株高、葉片數(shù)、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等做出評(píng)判，從而對(duì)不同品種加以鑒別。田間小區(qū)種植鑒定方式多種多樣，可在當(dāng)?shù)赝尽?dāng)?shù)禺惣净虍惖禺惣痉N植鑒定。但該方法鑒定費(fèi)工、費(fèi)時(shí)且周期長(zhǎng)，對(duì)鑒定人員、種植田塊及田間管理要求較高。要求田間種植小區(qū)需要具有能使鑒定性狀正常生長(zhǎng)發(fā)育的氣候、土壤及栽培條件，并對(duì)病蟲(chóng)害有相對(duì)的防護(hù)措施；要求鑒定人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握鑒定品種的特征特性，才能正確鑒別。

1.2 同工酶電泳技術(shù)

酶是生物代謝中的一種特殊蛋白質(zhì)，同工酶是指同一生物體或同一組織中催化相同化學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)不同的一類酶。其結(jié)構(gòu)的差異來(lái)源于基因型的差異。在作物種子純度鑒定中，常用的是多態(tài)性較強(qiáng)的脂酶和過(guò)氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。這種電泳利用電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和不連續(xù)系統(tǒng)的濃縮效應(yīng)，將蛋白質(zhì)或由蛋白質(zhì)組成的同工酶進(jìn)行分離。該法分辨率高，不易與樣品相互作用，具有熱穩(wěn)定、無(wú)色透明、純度高等優(yōu)點(diǎn)。因此是目前種子純度鑒定中研究較多、應(yīng)用較廣的電泳方法。目前已經(jīng)應(yīng)用此法對(duì)向日葵[1]、玉米[2]、甜椒[3]等品種進(jìn)行純度鑒定。該方法在使用過(guò)程中對(duì)酶的提取和電泳條件要求嚴(yán)格，如分離膠的濃度、濃縮膠的高度、催化劑的濃度及用量、溫度等等都對(duì)電泳的最終結(jié)果產(chǎn)生影響，某些同工酶的種類易隨生活力和發(fā)育進(jìn)程的變化而變化，從而對(duì)種子純度鑒定產(chǎn)生不利的影響，因此需要不斷的實(shí)驗(yàn)，找到適合某一作物的最好條件。

1.3 蛋白質(zhì)電泳法

蛋白質(zhì)電泳技術(shù)是從種子中提取蛋白質(zhì)，在某些方面彌補(bǔ)了同工酶電泳的缺點(diǎn)。蛋白質(zhì)的提取容易且無(wú)需低溫條件，縮短了周期；蛋白質(zhì)成分?jǐn)?shù)量穩(wěn)定，不受外界環(huán)境條件的影響。目前該方法在小麥種子酸溶蛋白和玉米種子鹽溶蛋白的應(yīng)用中比較多，效果也比較好。

1.4 DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)

通過(guò)對(duì)品種DNA的多態(tài)性即DNA堿基序列的差異進(jìn)行分析，從而鑒別不同品種。該方法檢測(cè)對(duì)象是品種的 DNA片段（基因），沒(méi)有器官的特異性，在植物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)；不受環(huán)境的影響，因DNA分子標(biāo)記的數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，這是同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)所無(wú)法比擬的；完全遵守簡(jiǎn)單的孟德?tīng)栠z傳方式，并具有體細(xì)胞穩(wěn)定性。目前DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)主要有以下幾個(gè)方面。

1.4.1 RFLP 作為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記，RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取→用限制性內(nèi)切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開(kāi)DNA片段→把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上→利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結(jié)果分析。RFLP反映了DNA序列中核酸排列順序的差異性。一個(gè)物種的DNA在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上發(fā)生了單個(gè)堿基突變、結(jié)構(gòu)重排（包括缺失、重復(fù)、易位和插入）以及甲基化等，均可導(dǎo)致限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。理論上講，每一個(gè)品種就是一種基因型，通過(guò)分析大多可以找到相對(duì)應(yīng)的RFLP指紋圖譜，利用這個(gè)RFLP指紋圖譜就可將這個(gè)品種與其它品種或混雜株區(qū)分開(kāi)來(lái)。但該方法更費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要進(jìn)行DNA多種酶切、轉(zhuǎn)膜以及探針的制備等多個(gè)步驟，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高，還要用到放射性元素，因此在品種純度鑒定應(yīng)用上受到一定的影響，目前已經(jīng)很少使用。

1.4.2 RAPD 該技術(shù)是1990年發(fā)明并發(fā)展起來(lái)的，RAPD是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列（通常為10個(gè)堿基對(duì)）為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。RAPD技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物的品種鑒定上。但RAPD技術(shù)對(duì)反應(yīng)條件十分敏感，因此RAPD標(biāo)記檢測(cè)作物種子純度時(shí)，必須使RAPD反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化、程序化，這包括DNA的提取、RAPD反應(yīng)混合物中各成分的濃度、電泳條件、溴化乙錠染色等；另外還必須建立每種作物品種種子純度的RAPD檢測(cè)技術(shù)操作規(guī)程，這樣RAPD檢測(cè)結(jié)果才可靠、準(zhǔn)確。目前RAPD方法鑒定種子純度已經(jīng)在油菜[4]、西瓜[5]、南瓜[6]、水稻[7]等作物上進(jìn)行了應(yīng)用，取得了很好的效果。

1.4.3 AFLP 該技術(shù)是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見(jiàn)切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。AFLP具有分析所需 DNA量少、可重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高、不需要 Southern雜交以及無(wú)放射性危害等特點(diǎn)。但是由于AFLP技術(shù)是一種專利技術(shù)，受專利保護(hù)，而且試劑盒價(jià)格昂貴，很難進(jìn)行批量鑒定，操作過(guò)程較為復(fù)雜，對(duì)操作人員技術(shù)要求高，并且對(duì)DNA提取純度和內(nèi)切酶質(zhì)量要求嚴(yán)格，一般人較難掌握，使其應(yīng)用受到一定的限制。目前應(yīng)用AFLP已經(jīng)成功地鑒定了茶樹(shù)[8]、白菜[8]及瓠瓜[10]等等。

1.4.4 SSR 該技術(shù)也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp，其中最常見(jiàn)是雙核酸重復(fù)，即（CA）n和（TG）n，每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10～60個(gè)，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)染色帶的差異來(lái)進(jìn)行純度鑒定。SSR具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：（1）復(fù)性溫度高，擴(kuò)增重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠；（2）微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。故可鑒別雜合子和純合子，對(duì)個(gè)體鑒定具有特殊意義；（3）SSR標(biāo)記技術(shù)所需的DNA量少，僅需要微量組織。即便DNA降解，其亦能有效分析鑒別。因此目前應(yīng)用SSR技術(shù)鑒定品種純度應(yīng)用比較廣泛，如黃瓜[11]、馬鈴薯[12]、大豆[13]、水稻[14]等等。

1.4.5 SRAP 是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，該標(biāo)記通過(guò)獨(dú)特的雙引物設(shè)計(jì)對(duì)基因的ORFs（Open reading frames）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物長(zhǎng)17bp，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。下游引物長(zhǎng)18bp，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高、共顯性高、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。目前SRAP技術(shù)在西瓜[15]、水稻[16]及花生[17]等作物的純度鑒定上已經(jīng)取得了一定的成果。

2 甜菜種子純度鑒定的常用方法

目前甜菜種子純度鑒定的微觀方法還沒(méi)有開(kāi)展，對(duì)甜菜種子純度鑒定方法通常采取田間小區(qū)種植法。如2008年10月，新疆伊犁州種子檢測(cè)中心，首次開(kāi)展了KWS9103甜菜種子真實(shí)性和品種純度種植鑒定。以進(jìn)口的KWS9103做對(duì)照，并進(jìn)行了認(rèn)真細(xì)致的田間記錄和管理，保證了鑒定田植株長(zhǎng)勢(shì)良好。同時(shí)在甜菜幼苗期和成長(zhǎng)期進(jìn)行了鑒定。證明此方法可行。

3 甜菜種子純度鑒定方法的展望

無(wú)論是田間鑒定技術(shù)還是生化鑒定技術(shù)，由于其鑒定的標(biāo)記數(shù)有限，不能滿足種子純度和種質(zhì)資源鑒定及育種工作的發(fā)展需要。目前國(guó)家加大了甜菜產(chǎn)業(yè)的投入，實(shí)施了甜菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)，隨著甜菜產(chǎn)業(yè)的繁榮，建立一套行之有效的甜菜種子純度鑒定方法尤為重要，而甜菜基因組DNA的快速提取方法已經(jīng)建立，相應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)如RFLP、RAPD、SRAP、SSR等也已經(jīng)應(yīng)用成功，而SSR和SRAP具有信息含量高、遺傳釋義明確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在品種真實(shí)性及種子純度鑒定中具有良好的應(yīng)用前景。而目前已經(jīng)有數(shù)十個(gè)甜菜SSR位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，SRAP引物更是多達(dá)上百對(duì)，因此在不久的將來(lái)，可望構(gòu)建完全由SSR標(biāo)記或SRAP標(biāo)記組成的基因組圖譜，建立DNA圖譜檔案和品種特有的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)；同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)成本，使質(zhì)檢部門易于接受以及更加簡(jiǎn)化種子DNA提取程序。進(jìn)一步推動(dòng)SSR及SRAP標(biāo)記在甜菜種子純度鑒定中的應(yīng)用，不久的將來(lái)會(huì)直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為甜菜種子糾紛仲裁作出科學(xué)的判斷。

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