王金河,孫海林,李洪敏,梁建琴,馮士生

(1.解放軍309醫(yī)院結(jié)研所結(jié)核二科,北京100091;2.鄂爾多斯二院結(jié)核科)

當(dāng)前,在治療MDR-TB的抗結(jié)核一線藥物大部分已經(jīng)耐藥[1-4],人們開(kāi)始把目光轉(zhuǎn)向二線藥物的應(yīng)用。其中,使用比較多的藥物是卡那霉素(KM)?，F(xiàn)在常規(guī)藥物敏感試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),臨床亦出現(xiàn) KM耐藥的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)?zāi)艹醪椒从辰Y(jié)核分枝桿菌耐KM的表面現(xiàn)象,但不能分析結(jié)核分枝桿菌是否發(fā)生本質(zhì)(km基因突變)的變化。本文運(yùn)用分子生物學(xué)方法,分析248株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的藥敏和km基因突變情況,研究KM耐藥水平和km基因之間的關(guān)系,尋找其內(nèi)在的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 菌種和菌株來(lái)源 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所;248株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來(lái)源于本院2006-2007結(jié)核科住院病人臨床標(biāo)本。

1.2 分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定和藥敏試驗(yàn) 按“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”進(jìn)行分枝桿菌BACTEC培養(yǎng)、菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。耐卡那霉素藥物濃度標(biāo)準(zhǔn):100μg/ml、10μg/ml和 1μg/ml分別為高度、中、低度耐藥[5-7]。

1.3 細(xì)菌DNA的制備 采用本室自制的標(biāo)本前處理試劑盒提取DNA,即:取標(biāo)本0.5～1 ml,加入等體積的1X Tris.Hcl-EDTA液,加入消化液50μl,混均至80℃水水浴30分鐘,每5分鐘混均1次,8 000 rpm 10分鐘,取上清1 ml。向樣本內(nèi)加入1 ml平衡酚,顛倒混勻數(shù)次,勿振蕩,8 000 rpm 10分鐘,取上層水相加入1ml酚/氯仿(1∶1)顛倒混勻數(shù)次,勿振蕩,8 000 rpm 10分鐘,重復(fù)操作一次。取上層水相加入1/10體積的醋酸鈉和等體積的無(wú)水乙醇,顛倒混勻,-20℃冷卻2小時(shí)。

隨后放置在4℃12 000 rpm離心10分鐘,棄上清,加等體積的70%乙醇顛倒混勻,放置在4℃12 000 rpm離心10分鐘,棄上清,將水控干,加50μl TE液,保存在4℃冰箱內(nèi),準(zhǔn)備下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.4 PCR擴(kuò)增 在25μl反應(yīng)體系中,4種dNTP的終濃度各為0.2mmol/L,引物1、2的終濃度各為0.4 μmol/L,純化的DNA模板10-100 ng,Taq DNA聚合酶1U。置DNA熱循環(huán)儀擴(kuò)增后,在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 PCR—SSCP初步菌種鑒定 結(jié)核分枝桿菌16S rDNA 124—275位核苷酸(按大腸桿菌16S rDNA的編碼位置)是原核生物高度變異的區(qū)域,擴(kuò)增該區(qū)域272 bp片段,在8%(29∶1)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,由于不同種細(xì)菌DNA單鏈的空間構(gòu)象不同,電泳后片段的遷移率也就不同,而呈現(xiàn)出不同的電泳圖譜。與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似的分離株判定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群;與其圖譜不同的分離株判定為非結(jié)核分枝桿菌。

1.6 PCR—SSCP分析km基因 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌km基因序列引物1和引物2可擴(kuò)增360 bp片段。均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%(59;1)。非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,銀染色后觀察結(jié)果并照相。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株做對(duì)照,與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株單鏈DNA遷移率相同的為野生型,出現(xiàn)泳動(dòng)變位的為突變型。

1.7 PCR—DS分析 設(shè)計(jì)、合成結(jié)核分支桿菌km引物k3、4的外部引物 k1、2,可擴(kuò)增 km基因產(chǎn)生360 bp片段,以k4為測(cè)序引物分析k1、2的擴(kuò)增片段。采用Promega公司生產(chǎn)的fmol DNA測(cè)序試劑盒,P—dATP購(gòu)自北京亞輝生物工程公司,測(cè)序電泳后,放射自顯影12小時(shí)至2天,肉眼識(shí)讀結(jié)果。疑是突變的結(jié)核分支桿菌分離株由上海生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 248株分枝桿菌分離株經(jīng)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物敏感株167株,耐卡那霉素分離株81株,耐藥率為32.7%(81/248)。其中高濃度耐藥占31株,中濃度耐藥占12株,低濃度耐藥占38株。

2.2 PCR—SSCP初步菌種鑒定 248株分枝桿菌分離株經(jīng)PCR—SSCP菌種鑒定分析,均與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的電泳圖譜相似,均產(chǎn)生272 bp片段,證明為結(jié)核分枝桿菌。

2.3 PCR—SSCP分析km基因 以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物為對(duì)照,81株臨床耐藥分離株的KM擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析發(fā)現(xiàn),57分離株SSCP均泳動(dòng)正常,24株SSCP出現(xiàn)泳動(dòng)變位,突變率為29.6%。

其中高度耐藥有14株出現(xiàn)泳動(dòng)變位,突變率為58.3%(14/24);中度耐藥有4株出現(xiàn)泳動(dòng)變位,突變率為22.2%(4/24);高濃度和中度突變差異顯著,P≤0.05。低濃度耐藥突變率為16.7%(4/24),同時(shí),經(jīng)PCR—DS測(cè)序分析,均為 km突變株,主要在341位密碼子突變,剩余6株單純低濃度耐藥無(wú)km基因突變。

3 討論

抗微生物新藥不斷涌現(xiàn),給感染性疾病的治療帶來(lái)福音。然而,由于抗微生物藥物的廣泛應(yīng)用或不恰當(dāng)使用,感染性疾病的病原體種類(lèi)、致病性和對(duì)抗生素的敏感性發(fā)生的變化,使經(jīng)驗(yàn)性抗微生物藥物的治療難以奏效。因此,a.正確掌握各類(lèi)微生物藥物的作用機(jī)制和細(xì)菌的耐藥機(jī)制,及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性和給予正確的解釋,是臨床工作的重要任務(wù)。b.隨著各種二線藥物的大量使用,二線藥物也出現(xiàn)耐藥的情況。為了將耐藥趨勢(shì)控制在最小范圍,WTO將二線藥物納入治療結(jié)核病的范圍[8,9]。為防止耐二線藥物的結(jié)核菌的傳播,必須對(duì)耐二線藥物的耐藥基因進(jìn)行細(xì)致、深入的研究,這是當(dāng)前一個(gè)十分重要的課題。

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility test,AST)意義在于:①可預(yù)測(cè)抗菌治療的效果,治療前做AST。即AST試驗(yàn)結(jié)果為“敏感”時(shí),今后治療可能有效;試驗(yàn)結(jié)果為“耐藥”時(shí),使用該藥物治療肯定失敗;②指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇使用抗生素,AST的結(jié)果往往在給予病人經(jīng)驗(yàn)性治療之后的結(jié)果,若結(jié)果為“耐藥”,即應(yīng)更換藥物;③提供所選擇藥物的依據(jù);④監(jiān)測(cè)耐藥性,分析耐藥菌的變遷,掌握耐藥菌感染病流行病學(xué),控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。傳統(tǒng)的結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)?zāi)艹醪椒从辰Y(jié)核分枝桿菌耐KM的表型現(xiàn)象,248株分枝桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,耐藥率為32.7%(81/248),耐藥率明顯低于抗結(jié)核一線藥物(抗結(jié)核一線五種藥物耐藥率均在40%以上)。

國(guó)內(nèi)常用抗結(jié)核二線藥物的一大類(lèi)為氨基糖苷類(lèi)(Aminoglucosides)?？筂DR-TB二線氨基糖苷類(lèi)主要包括:卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、依替米星、硫酸依替米星、異帕米星等?？敲顾?Kanamycin)又是二線氨基糖苷類(lèi)藥物使用最廣、時(shí)間最久的藥物,本文著重研究卡那霉素的耐藥基因突變情況。

卡那霉素的作用機(jī)制和結(jié)核分枝桿菌耐卡那霉素的機(jī)制還不十分清楚,結(jié)核菌耐二線氨基糖苷類(lèi)藥物的作用機(jī)制是通過(guò)km基因?qū)崿F(xiàn)的?？敲顾厥且环N氨基糖苷類(lèi),其主要作用是影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,包括(1)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的始動(dòng)階段70S始動(dòng)復(fù)合物的形成;(2)能使密碼mRNA與不配對(duì)的aa-tRNA結(jié)合,出現(xiàn)大量錯(cuò)配,形成無(wú)用蛋白質(zhì);(3)還可以抑制肽鏈從終止密碼上脫落,以便殺滅細(xì)菌;(4)亦有人認(rèn)為細(xì)菌蛋白質(zhì)合成被抑制的同時(shí),細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)合成也被抑制,使藥物更易進(jìn)入胞漿,造成惡性循環(huán),細(xì)菌胞內(nèi)必須成分外逸,是造成細(xì)菌死亡的又一原因。因此,卡那霉素是治療MDR-TB方案中有效的常用藥物之一。因其抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成作用廣泛,與其它一線抗結(jié)核藥物相比,耐藥率最低(32.7%),其中km基因(尤其是341位密碼子)突變是耐卡那霉素產(chǎn)生的主要原因。

結(jié)核分枝桿菌km基因突變使菌體蛋白質(zhì)合成結(jié)構(gòu)改變,卡那霉素藥物不能影響菌蛋白質(zhì)的相互作用,而導(dǎo)致耐卡那霉素菌的產(chǎn)生。km基因突變與卡那霉素耐藥水平有一定關(guān)系,km基因突變的分離株卡那霉素藥物M ICs通常為100μg/ml-10μg/ml之間,M IC在 ≥100μg/ml的分離株突變率為55.5%,M IC在 ≥10μg/ml的分離株突變率為22.2%,1μg/ml亦可見(jiàn)km基因突變,說(shuō)明km基因突變區(qū)域范圍廣泛,且km基因突變主要在高濃度范圍發(fā)生。

本文通過(guò)PCR—SSCP技術(shù)分析了81株結(jié)核分枝桿菌耐卡那霉素分離株的km基因,突變率為29.6%,本文約70.4%耐藥分離株無(wú)基因突變,可能是部分中、低濃度耐藥菌還沒(méi)有到達(dá)基因突變的程度;也可能是PCR-SSCP技術(shù)本身的局限性未能檢測(cè)出所有的突變,或由于km基因其它部位突變或由其它耐藥基因突變所致,或存在其它耐藥機(jī)制。

目前,在我國(guó)臨床應(yīng)用卡那霉素藥物比較廣泛,從本文分析中得知該藥是一種比較穩(wěn)定的藥物,其殺菌作用廣泛,在短期治療結(jié)核病的過(guò)程中,不易引起結(jié)核菌的耐藥。即使耐藥,km基因突變區(qū)域也主要在高濃度范圍。然而,臨床還應(yīng)根據(jù)耐藥水平和耐藥基因分析情況,進(jìn)行有針對(duì)性的治療,這樣才能使MDR-TB病治療有效。

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