鄭順亮， 李開(kāi)通， 楊 帥， 張藝軒， 石 鉞

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193)

清絡(luò)方由苦參、青風(fēng)藤、黃柏組成，為新安名醫(yī)“張一貼”的祖?zhèn)鞣剿?，是基于中醫(yī)“絡(luò)病”理論，針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎“濕熱阻絡(luò)證”的代表方劑，功擅清熱除濕、通絡(luò)開(kāi)痹，臨床上用于早、中期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，清絡(luò)方能顯著減少滑膜毛細(xì)血管增生、防止血管翳形成，改善軟骨破壞、減輕滑膜細(xì)胞亢進(jìn)的分泌功能及代謝活性，并能夠顯著減少CIA大鼠滑膜組織中MMP3mRNA的合成，從而矯正、防治“絡(luò)道亢變”所致的“血管新生”［1］，該研究被認(rèn)為是目前進(jìn)行中醫(yī)方劑與血管增生的較早研究之一［2］。我們對(duì)清絡(luò)方進(jìn)行了提取分離，結(jié)合活性篩選，確定了其抑制血管新生的活性部位，為闡明其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)活性部位進(jìn)行系統(tǒng)分離，已經(jīng)獲得并鑒定結(jié)構(gòu)的化合物為:β－谷甾醇、正二十六烷酸、石虎檸檬素A、黃柏內(nèi)酯、苦參堿、槐果堿、尖防己堿、青藤堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、尖防己定堿、胡蘿卜苷、三葉豆紫檀苷、巴馬汀、小檗堿、丁香苷、丁香脂素－4，4′－O－雙－β－D－葡萄糖苷。其中石虎檸檬素A和正二十六烷酸屬首次在組成清絡(luò)方的三味中藥苦參、青風(fēng)藤、黃柏中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結(jié)構(gòu)類型和生源途徑判斷石虎檸檬素A很可能來(lái)源于黃柏，正二十六烷酸來(lái)源于苦參。

1 儀器與試劑

Fisher－Johns顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(未校正，美國(guó));TU－1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);FTIR－8400S型紅外光譜儀(KBr壓片，日本);Bruker AVANCE DRX－500型核磁共振儀;VARIAN INOVA－500型核磁共振儀;Magnet質(zhì)譜儀;SENCO－R型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);KQ－100型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);ZF－C型三用紫外燈(上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司)。

薄層層析和柱層析硅膠(青島海洋化工廠出品);Sephadex LH－20(美國(guó)GE公司出品);中性氧化鋁(溫州市東升化工試劑廠出品);聚酰胺薄膜(浙江四青生化材料廠出品)。所用化學(xué)試劑均為分析純。

清絡(luò)方組方中各單味藥均購(gòu)自北京同仁堂京北藥店，原植物學(xué)名經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館李國(guó)強(qiáng)博士鑒定?？鄥槎箍苹睂僦参锟鄥ophora flavescens Ait.的干燥根，青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.干燥藤莖，黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodendron amurense Rupr.(關(guān)黃柏)的干燥樹皮。

2 提取分離

根據(jù)清絡(luò)方配方比例，取全方共6.8 kg，70%乙醇回流提取2次，每次1 h，提取液濾過(guò)，回收乙醇，得浸膏。加水分散，上大孔吸附樹脂，分別用水和稀乙醇進(jìn)行洗脫，得到水洗脫部分和稀醇洗脫部分。

取稀醇洗脫部分100 g進(jìn)行硅膠(200～300目)柱層析，二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脫，按每流份100 mL收集，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)合并相同流份，得到8個(gè)部分。對(duì)其中第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部分又分別進(jìn)行硅膠(300～400目)柱層析，用二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脫，Ⅱ:4～7份放置析出結(jié)晶，得到化合物1;Ⅲ:81～94份再進(jìn)行硅膠(300～400目)柱層析，用二氯甲烷－甲醇不同比例梯度洗脫，得到化合物2和3;95～99份作相同處理，得到化合物4，其余合并，回收至小體積，氧化鋁柱層析，乙酸乙酯－無(wú)水乙醇－三乙胺(200:1:0.5洗脫)，得到化合物5和6;100～118份作相同處理，得到化合物7、8、9和10;Ⅳ:119～153份作相同處理，得到化合物11、12和13;Ⅴ:156～171份合并，回收至小體積，硅膠制備薄層層析，二氯甲烷－甲醇(88:22)展開(kāi)，得到化合物14;156～171份放置后析出沉淀，反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物15;119～153份硅膠柱層析，二氯甲烷－甲醇梯度洗脫，得到化合物16;Ⅵ:200～213份合并回收至小體積，上Sephadex LH－20凝膠柱，甲醇洗脫，回收至小體積，放置后析出沉淀，反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物17。

3 鑒定

化合物1:白色片狀結(jié)晶(甲醇)，mp 134～136℃。Liebermann－Burchard 反應(yīng)呈陽(yáng)性。EI－MS m/z:414(M+)，396(M+－H2O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［3］報(bào)道相同，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為 β－谷甾醇(β－sitosterol)。

化合物2:白色無(wú)定形粉末，mp 72～73℃。IR(KBr)cm－1:2 500 ～3 400(OH)，2 955(C－H)，2 918(C－H)，2 849(C－H)，1 707(C=O)，1 464，719。EIMS m/z:396(M+)，368(M+－CO)，354，185，129，73，60，符合飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸裂解規(guī)律。1H－NMR(CDCl3)δ:2.35(2H，t，J=7.5 Hz，α－CH2)，1.63(2H，m，β－CH2)，1.25 ～1.30(44H，br，CH2×22)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，長(zhǎng)鏈端基 CH3)。13C－NMR中，δ179.0示有羧基，δ14.1示1個(gè)甲基，δ 22.7～δ33.9為長(zhǎng)鏈中的多個(gè)亞甲基碳信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4－5］報(bào)道一致，故確定為正二十六烷酸(hexacosanoic acid)。

化合物3:無(wú)色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 289～291℃。EI－MS:502(M+)，487(M+－CH3)，485(M+－OH)，445，415，347，332，248，235，168，147，135，109，91，69，55。該化合物光譜特征和化合物 4(黃柏內(nèi)酯)很相似，其差異在于17位取代基是半縮醛結(jié)構(gòu)的不飽和結(jié)構(gòu)的五元內(nèi)酯，1H－NMR中22位氫的化學(xué)位移值6.29是單峰，可推斷與母核相連的五元內(nèi)酯環(huán)為結(jié)構(gòu)片段Ⅰ(若為結(jié)構(gòu)片段Ⅱ，則22位氫的化學(xué)位移值應(yīng)在更低場(chǎng)，約7.30);δ8.15(1H，br.s)為與21位碳相連的羥基的氫信號(hào)，δ6.08(1H，br.s，H－21)，δc:169.0(C－23)，20 位碳的化學(xué)位移δc是163.7，在如此低場(chǎng)，可佐證與母核相連的五元內(nèi)酯環(huán)為結(jié)構(gòu)片段Ⅰ，也可推出雙鍵與羰基共軛效應(yīng);δ122.1(C－22)，δ98.2(C－21)。1H－NMR 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，13C－NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致(表1和表2)，故確定石虎檸檬素A(shihulinmonin A)。見(jiàn)圖1。

圖1 石虎檸檬素A化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 化合物3和4的1H-NMR數(shù)據(jù)

化合物4:無(wú)色透明方晶(甲醇)，mp 292～294℃。10%硫酸乙醇顯色為紫紅色。EI－MS m/z:470(M+)，455(M－CH3)，413，358，347(基峰)。1HNMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)(見(jiàn)表 1 和表 2)與文獻(xiàn)［7－8］報(bào)道一致，故確定為黃柏內(nèi)酯(obaculactone)。

化合物5:白色針狀結(jié)晶(石油醚)，mp 75～77℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):211 nm。1H－NMR中顯示苦參堿型生物堿δ4.40(1H，dd，J=12.5，4.0 Hz，He－17)、δ3.05(1H，t，J=12.5 Hz，Ha－17)和 δ3.82(1H，m，H－11)的信號(hào)。13C－NMR中顯示內(nèi)酰胺(δ169.4)和喹諾里西啶環(huán)上的碳信號(hào)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為苦參堿(matrine)。

化合物6:白色針狀結(jié)晶(石油醚)，mp 54～56℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):206 nm，258 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［9］一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為槐果堿(sophocarpine)。

化合物7:白色無(wú)定形粉末，mp 240～241℃。Dragendorff’s reagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。EI－MS m/z:399，397(M+)，362(M+－Cl)，334，209(基峰);m/z 399峰高約為m/z 397峰高的1/3，說(shuō)明該化合物中可能含有氯原子。1H－NMR(DMSO－d6)中:δ6.15(1H，d，J=6.0)為1位羥基質(zhì)子信號(hào);δ5.42(1H，s)為3位烯氫的信號(hào)峰;δ4.58(1H，d，J=6.0 Hz，H－1)，δ 4.48(1H，dd，J=12.0，7.0 Hz，H－10);δ3.99(3H，s)，δ3.86(3H，s)和 δ3.55(3H，s)分別為 19－、18－、17－位－OCH3中氫的信號(hào)峰，δ2.27(3H，s)為－NCH3中質(zhì)子信號(hào)峰。13C－NMR(DMSO－d6)中顯示 19 個(gè)碳原子信號(hào)，分別為:200.7(C－4)，192.2(C－6)，188.7(C－2)，159.6(C－8)，138.0(C－7)，105.0(C－3)，72.0(C－13)，69.5(C－1)，67.3(C－11)，60.4(C－19)，59.9(C－18)，59.1(C－17)，57.0(C－10)，52.5(C－12)，51.2(C－15)，45.9(C－5)，40.6(C－9)，37.7(C－14)，36.2(C－16)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10－11］數(shù)據(jù)一致，因此鑒定為尖防己堿(acutumine)。

表2 化合物3和4的13C-NMR數(shù)據(jù)

化合物8:白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 160～162℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):214 nm，262 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［12］一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為青藤堿(sinomenine)。

化合物9:白色棱狀結(jié)晶(丙酮)，mp 202～204℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):216 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為氧化苦參堿(oxymatrine)。

化合物10:白色片狀結(jié)晶(丙酮)，mp 205～207℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):206 nm，255 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［9］一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為氧化槐果堿(oxysophocarpine)。

化合物11:白色細(xì)針狀晶體(甲醇)，mp 237～239 ℃，Dragendorff’s reagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。EI－MS m/z:385，383(M+)，348(M+－Cl)，320，295(基峰);m/z 385峰高約為m/z 383峰高的1/3，說(shuō)明該化合物中可能含有氯原子。其質(zhì)譜裂解規(guī)律與化合物7(尖防己堿)相似，各碎片峰的質(zhì)量數(shù)與尖防己堿相比，都減去14(－CH2－)。該化合物核磁共振的光譜特征與化合物7(尖防己堿)也相似，只是少了－NCH3信號(hào)峰。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］數(shù)據(jù)一致，因此鑒定為 N－去甲尖防己堿，即尖防己定堿(acutumidine)。

化合物12:白色無(wú)定形粉末，mp 286～288℃，Liebermann－Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，Molish反應(yīng)陽(yáng)性。EI－MS m/z:414(M+－glc)，396(M+－glc－H2O)。核磁數(shù)據(jù)與β－谷甾醇相對(duì)照，除糖上的碳?xì)湫盘?hào)外，具有高度的相似性。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為胡蘿卜苷(daucosterol)。

化合物13:白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 142～144℃，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性。EI－MS m/z:284(M+－glc)。1HNMR(DMSO－d6)δ:7.36(1H，d，J=8.5 Hz，H－1)，6.98(1H，s，H－7)，6.70(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H－2)，6.55(1H，d，J=2.0Hz，H－4)，6.52(1H，s，H－10)，5.95、5.91(each 1H，s，－OCH2O－)，5.57(1H，d，J=8.5 Hz，H－11a)，4.84(1H，d，J=7.5 Hz，H－1′)，4.27(1H，dd，J=10.75，4.5 Hz，H－6eq)，3.68(1H，m，H－6a)，3.45(1H，m，H－6ax)，3.13 ～5.58 為糖上質(zhì)子信號(hào)。13C－NMR(DMSO－d6)δ:158.6(C－3)，156.3(C－4a)，153.8(C－10a)，147.6(C－9)，141.6(C－8)，131.9(C－1)，118.4(C－6b)，114.3(C－11b)，110.5(C－2)，105.5(C－7)，104.2(C－4)，101.2(－OCH2O－)，100.5(C－1′)，93.4(C－10)，77.8(C－11a)，77.2(C－5′)，76.7(C－3′)，73.3(C－2′)，69.8(C－4′)，66.0(C－6)，60.8(C－6′)，40.2(C－6a)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道一致，故確定為高麗槐素－7－O－β－D－葡萄糖苷，即三葉豆紫檀苷(triforlirhizin)。

化合物14:黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 198～200℃。Dragendorff’sreagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):266 nm，348 nm。EI－MS m/z:352(M+)。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為巴馬汀(palmatine)。

化合物15:黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 183～185℃。Dragendorff’s reagent反應(yīng)顯陽(yáng)性。UV(MeOH):266 nm，350 nm。其1H－NMR、13C－NMR 等數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］基本一致，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，混合熔點(diǎn)不下降，其薄層結(jié)果一致，故確定為小檗堿(berberine)。

化合物16:白色無(wú)定形粉末，mp 183～184℃。Molish 反應(yīng)呈陽(yáng)性。EI－MS m/z:210(M+－glc)。1HNMR(CD3OD)δ:6.74(2H，s，H－2，H－6)，6.54(1H，d，J=16.0 Hz，H－7)，6.32(1H，dt，J=16.0，5.5 Hz，H－8)，4.86(1H，d，J=7.5 Hz，H－1′)，4.21(2H，dd，J=5.5，1.5 Hz，H－9)，3.85(6H，s，3－OCH3，5－OCH3)，3.40(2H，m，6′－CH2)，3.18 ～ 3.82(4H，m，糖上的－CH)。13C－NMR(CD3OD)δ:154.9(C－3，C－5)，136.4(C－4)，135.8(C－1)，131.8(C－7)，130.6(C－8)，106.0(C－2，C－6)，105.9(C－1′)，78.9(C－5′)，78.4(C－3′)，76.3(C－2′)，71.9(C－4′)，64.1(C－9)，63.1(C－6′)，57.5(2 × OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17］報(bào)道一致，故確定為丁香苷(syringin)。

化合物17:白色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp 257～259℃;Molish反應(yīng)陽(yáng)性。EI－MS m/z:418(M+－2 ×glc)。1H－NMR(DMSO－d6)δ:6.66(4H，s，H－2′，H－6′，H－2″，H－6″)，4.92(4H，dd，J=6.5，4.0 Hz，4 × glc－OH)，4.88(4H，d，J=5.0 Hz，H－glc－1，H－glc－1′，2 ×glc－OH)，4.67(2H，d，J=3.5 Hz，2，6－H)，4.26(2H，t，J=5.5 Hz，glc－6－OH，glc－6′－OH)，4.20(2H，dd，J=9.5，6.5 Hz，H－4e，H－8e)，3.83(2H，dd，J=9.5，3.0 Hz，H－4a，H－8a)，3.76(12H，s，3′－OCH3，5′－OCH3，3″－OCH3，5″－OCH3)，3.60(2H，dd，J=9.5，5.5 Hz，H－glc－6e，H－glc－6′e)，3.41(2H，dd，J=11.25，5.5 Hz，H－glc－6a，H－glc－6′a)，3.01 ～ 3.20(8H，m，H－glc－2 ～ 5，H－glc－2′～5′)，3.10(2H，m，H－1，H－5)。13C－NMR(DMSO－d6)δ:152.8(C－3′，C－5′，C－3″，C－5″)，137.3(C－1′，C－1″)，134.0(C－4′，C－4″)，104.5(C2′，C－6′，C－2″，C－6″)，102.9(C－glc－1，C－glc－1′)，85.2(C－2，C－6)，77.4(C－glc－5，C－glc－5′)，76.7(C－glc－3，C－glc－3′)，74.3(C－glc2，C－glc－2′)，71.5(C－4，C－8)，70.1(C－glc－4，C－glc－4′)，61.1(C－glc－6，C－glc－6′)，56.6(3′－OCH3，5′－OCH3，3″－OCH3，5″－OCH3)，53.8(C－1，C－5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道一致，故確定為丁香脂素－4，4′－O－雙－β－D－葡萄糖苷。

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