陸國慶， 張軒邈， 鄭新川， 朱仝飛， 何鳳慈

(1.第三軍醫(yī)大學科研部，重慶400038;2.四川大學華西藥學院，四川成都610041;3.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院生物醫(yī)學綜合實驗研究中心，重慶400038;4.成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學科，四川成都610083)

冬凌草甲素(Oridonin，ORI)最早是從冬凌草中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(ent－kaurene diterpenoid)天然有機化合物，白色棱柱狀晶體，味極苦，極微溶于水和油脂中，可溶于甲醇等有機溶劑［1］。ORI細胞毒性較強，藥理學實驗表明具有較強的抗癌活性，可有效抑制多種腫瘤細胞增殖，包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、急性粒細胞白血病、多形性惡性腦膠質(zhì)瘤細胞等［2－5］。但由于ORI特殊的理化性質(zhì)，造成常規(guī)制劑溶解性差，毒副作用大，機體吸收差，制約了藥物療效的發(fā)揮，其應用受到限制。目前還沒有理想的藥物傳遞系統(tǒng)。

膽鹽/磷脂混合膠束(Bile Salt－Phosphatidylcholine－Mixed Micelles，BS/PC－MM)系統(tǒng)不僅可顯著提高難溶性藥物的溶解能力，還可增強藥物療效，減少輔料對機體的不良反應，是一種生物相容性藥物傳遞系統(tǒng)。國外學者已成功應用于多烯紫杉醇、替尼泊苷、地西泮類等藥物的增溶［6－10］。本研究利用BS/PC－MM，以期提高ORI的溶解性能，并獲得納米粒徑藥物傳遞系統(tǒng)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1200，Agilent公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Büchi公司):V－800 蒸發(fā)器，V－500 真空裝置，B－490水浴裝置，B－740冷凝器;納米粒度及電位分析儀(英國 Malvern Zeta Sizer－Nano ZS90);透射電子顯微鏡(荷蘭PHILIPS公司，TECNAI 10);艾科普高端超純水系統(tǒng)(ACD－6000－U);低溫高速離心機(Eppendorf，5417R);電子天平(Sartorius，BS223S，max 220 g，d=0.001 g;Sartorius BP61S，max 61 g，d=0.1 mg);pH計(METTLER TOLEDO);超聲清洗儀(KQ－50B，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

冬凌草甲素(Oridonin，ORI)(＞98.07%，西安旭煌生物科技有限公司，081216);大豆磷脂(Soya Phosphatidylcholine，SPC)(PC＞90%，上海太偉藥業(yè)有限公司，20080320);脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDC)(＞90%，北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司，20090114);甲醇為色譜純，無水乙醇為分析純，水為超純水(pH 7.2)。

2 實驗方法

2.1 共沉淀法制備冬凌草甲素膽鹽/磷脂混合膠束、空白混合膠束 結(jié)合參考文獻方法［6－10］，稱取處方量的ORI、脫氧膽酸鈉、大豆磷脂，加入適量無水乙醇，超聲溶解至澄清，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡有機溶劑，加入適量水化介質(zhì)，旋轉(zhuǎn)水化、洗脫，轉(zhuǎn)移至離心管中，13 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，即得 ORI－BS/PC－MM，空白膠束同法制備。

2.2 ORI含量測定方法建立

2.2.1 色譜條件［11－12］色譜柱:(ECLIPSE XDBC18色譜柱4.6 mm ×150 mm ×5 μm)，流動相:甲醇－水(60∶40)，檢測波長為240 nm，柱溫:35℃，流速:1 mL/min，進樣量:20 μL。

2.2.2 標準曲線 精密稱取ORI原料藥102.3 mg，置于250 mL量瓶，甲醇溶解并定容，得409.2 mg/L貯備液;分別精密吸取適量貯備液至10 mL量瓶，甲醇定容成 2.05、4.09、8.18、16.37、40.92、81.84、204.60 mg/L溶液，按照2.2.1項色譜條件進樣，以O(shè)RI峰面積A對濃度C進行線性回歸，得線性回歸方程。

2.2.3 精密度 取ORI溶液高、中、低3個濃度組，按照2.2.1項色譜條件連續(xù)進樣5次(日內(nèi)精密度)，連續(xù)測定5 d(日間精密度)。

2.2.4 回收率 精密量取ORI貯備液0.1、0.4、2.0 mL，分別加入相應比例的空白膠束溶液(磷脂比例0.4，輔料總濃度2.5%)，甲醇定容至10 mL，按照2.2.1項色譜條件進樣，測定回收率。

2.2.5 穩(wěn)定性 精密吸取 ORI－BS/PC－MM(磷脂比例0.4，輔料總濃度2.5%，ORI 5 mg/mL)0.1 mL，甲醇定容至 10 mL，室溫放置，于 0、2、4、6、24 h取樣，按照2.2.1項色譜條件進樣，計算變異系數(shù)V。

2.2.6 含量測定 精密吸取 ORI－BS/PC－MM 適量，甲醇定容至10 mL，混勻后0.22 μm有機濾膜過濾，按照2.2.1色譜條件進樣，按照所得峰面積A推算ORI濃度C。

2.3 ORI－BS/PC－MM 制備的單因素考察［6－10］擬定不同的考察因素，投入過量ORI原料藥，稱取處方量的脫氧膽酸鈉、大豆磷脂，加入適量無水乙醇，超聲溶解至澄清，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除盡有機溶劑，加入適量水化介質(zhì)，旋轉(zhuǎn)水化、洗脫，轉(zhuǎn)移至離心管中，13 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，即得 ORI－BS/PC－MM。按照 2.2.6項方法測定ORI濃度，計算其溶解度和載藥量(ORI/(脫氧膽酸鈉+大豆磷脂)%)。

2.3.1 不同磷脂比例(大豆磷脂占輔料的摩爾比)固定輔料總濃度為2.5%，25℃超純水水化，考察不同磷脂比例分別為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6情況下，ORI的溶解度差異。

2.3.2 不同輔料總濃度(大豆磷脂與脫氧膽酸鈉在100 mL溶液中所占的質(zhì)量百分比) 固定磷脂比例為0.3，25℃超純水水化，考察不同輔料總濃度1%、3%、5%、7%、10%情況下，ORI的溶解度及載藥量的差異。

2.3.3 不同pH值水化介質(zhì) 固定輔料總濃度2.5%，磷脂比例0.3，25℃離子強度為0.1 mol/kg PBS作為水化介質(zhì)，制備混合膠束，考察不同pH值水化介質(zhì)(pH2.0、pH5.8、pH6.4、pH7.4、pH8.0)情況下，ORI的溶解度差異。

2.3.4 不同離子強度 固定輔料總濃度2.5%，磷脂比例0.3，25℃ NaCl溶液水化，制備混合膠束，考察離子強度分別為 0.05、0.15、0.30、0.6、0.92、1.85、3.70 mol/kg的NaCl溶液作為水化介質(zhì)，ORI的溶解度差異。

2.3.5 不同水化溫度 固定輔料總濃度2.5%，磷脂比例0.3，超純水水化，制備混合膠束，考察水化溫度分別為10℃、25℃、37℃、45℃、60℃時，ORI的溶解度差異。

2.4 稀釋穩(wěn)定性 根據(jù)ORI的前期臨床試用劑量(75 mg/d)，參考臨床靜脈輸液配制方法，將含ORI 75 mg的載藥膠束5 mL稀釋至100 mL 0.9%NaCl溶液及500 mL 5%葡萄糖溶液中，HPLC考察不同磷脂比例(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6)情況下，混合膠束的稀釋穩(wěn)定性(0 h、24 h、48 h、72 h、100 h)。

2.5 膠束粒徑及Zeta電位測定 固定輔料總濃度2.5%，磷脂比例0.3，ORI濃度為1 mg/mL，制備載藥、空白膠束，水化后13 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋至ORI濃度為0.5 mg/mL，測定平均粒徑及Zeta電位。

2.6 膠束形態(tài)測定 固定輔料總濃度2.5%，磷脂比例0.3，ORI濃度為1 mg/mL，制備載藥膠束，水化后13 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋至ORI濃度為0.5 mg/mL，將稀釋好的膠束溶液滴加至銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸鈉液復染，在透射電鏡下觀察并進行照相。

3 結(jié)果

3.1 標準曲線的制定 由實驗可知，ORI的濃度C與峰面積A之間具有良好的線性關(guān)系，標準曲線方程為 A=25.661C －14.008，r=0.999 9(n=7)，線性范圍(2.05～204.60)mg/L;以S/N≥10確定定量限，本實驗最低線性范圍2.05 mg/L時，S/N＞10;日內(nèi)高、中、低3個濃度組 RSD分別為0.26%、0.52%、2.33%，日間高、中、低3個濃度組RSD分別為0.49%、2.18%、1.55%;高、中、低3個濃度組平均回收率分別為97.69%、98.21%、104.12%;變異系數(shù)V≤1.62%，表明樣品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 ORI－BS/PC－MM 制備的單因素考察結(jié)果

3.2.1 不同磷脂比例 隨著大豆磷脂比例(0～0.6)的不斷增加，可以導致ORI溶解度的逐漸下降，溶解度范圍為(11.25±0.35)mg/mL～(4.66±0.41)mg/mL。見圖1。

圖1 磷脂比例對ORI在膠束中溶解度的影響(n=3，±s)

3.2.2 不同輔料總濃度 不斷增加輔料總濃度(1% ～10%)，ORI溶解度逐漸增加，溶解度范圍為(3.77±0.40)～(19.74±0.96)mg/mL;載藥量逐漸下降，載藥量范圍為(37.73±3.97)% ～(19.74±0.96)%。見圖2。

圖2 不同輔料總濃度對ORI在膠束中溶解度及載藥量的影響(n=3，±s)

3.2.3 不同pH值水化介質(zhì) 水化介質(zhì)pH值在6.4～8.0范圍內(nèi)時，ORI具有較好的溶解性能，pH值為7.4的PBS中，ORI溶解度為(9.84±0.25)mg/mL，見圖3。因此，采用pH為7.2的超純水作為水化介質(zhì)即可取得較好的溶解效果。

3.2.4 不同離子強度 隨著水化介質(zhì)離子強度的增加，ORI的溶解度逐漸下降，其中離子強度0.05 mol/kg組溶解度為(8.86±0.43)mg/mL，離子強度3.70 mol/kg組溶解度為(2.46±0.34)mg/mL，見圖4。因此，采用離子強度為0的超純水作為水化介質(zhì)即可取得較好的溶解效果。

圖3 pH值對ORI在膠束中溶解度的影響(n=3，±s)

圖4 離子強度對ORI在膠束中溶解度的影響(n=3，±s)

3.2.5 不同水化溫度 10℃、25℃及37℃均可取得較好溶解效果，溶解度分別為(8.24±0.35)mg/mL，(9.11±0.19)mg/mL，(8.74±0.42)mg/mL，見圖5。因此，采用室溫水化介質(zhì)即可。

圖5 水化溫度對ORI在膠束中溶解度的影響(n=3，±s)

3.3 稀釋穩(wěn)定性 結(jié)果顯示:稀釋至100mL 0.9%NaCl組中ORI最低濃度組為(93.4±0.3)%(磷脂比例為0.2);稀釋至500 mL 5%葡萄糖組中ORI最低濃度組為(94.7±1.9)%(磷脂比例為0.4)。兩組稀釋情況顯示RSD(%)＜5.00%，說明不同時間點的藥物含量變化情況較小，不同磷脂比例的ORIBS/PC－MM均具有較好的抗稀釋能力。稀釋至100 mL 0.9%NaCl組見表1，稀釋至500mL 5%葡萄糖組見表2。

表1 不同磷脂比例情況下混合膠束的稀釋穩(wěn)定性(n=3，±s)

表1 不同磷脂比例情況下混合膠束的稀釋穩(wěn)定性(n=3，±s)

0.00 100.00 96.59±0.48 96.28±0.26 95.41±0.19 93.94±0.29 2.24 0.10 100.00 96.46±0.97 94.21±0.35 97.60±0.10 97.00±0.18 2.09 0.20 100.00 100.31±1.69 93.43±0.84 96.96±0.52 93.38±0.27 3.38 0.30 100.00 98.97±0.47 98.59±0.42 96.15±0.18 97.33±0.77 1.50 0.40 100.00 102.21±0.53 96.37±0.86 95.35±0.04 100.20±1.29 2.86 0.50 100.00 100.83±0.40 94.47±0.68 95.39±0.10 94.94±0.24 3.03 0.60 100.00 99.38±0.31 94.77±0.67 95.43±0.92 95.50±0.59 2.47

表2 不同磷脂比例情況下混合膠束的稀釋穩(wěn)定性(n=3，±s)

表2 不同磷脂比例情況下混合膠束的稀釋穩(wěn)定性(n=3，±s)

0.00 100.00 98.87±0.70 97.90±0.71 97.50±0.66 95.60±1.09 1.64 0.10 100.00 99.19±0.05 97.86±1.28 97.07±1.22 96.33±0.38 1.50 0.20 100.00 99.51±0.73 97.98±0.25 96.25±0.28 95.73±0.47 1.90 0.30 100.00 99.17±0.28 98.46±0.15 95.63±0.75 95.08±0.77 2.19 0.40 100.00 99.00±0.68 98.94±0.93 96.56±0.26 94.71±1.28 2.16 0.50 100.00 98.02±0.63 98.31±0.86 95.93±0.92 95.13±0.10 1.95 0.60 100.00 98.78±1.46 99.24±0.84 95.78±1.07 96.74±1.23 1.78

3.4 膠束粒徑、Zeta電位測定結(jié)果 載藥、空白膠束的粒徑、Zeta電位測定結(jié)果見表3。

表3 混合膠束的平均粒徑、Zeta電位(n=3，±s)

表3 混合膠束的平均粒徑、Zeta電位(n=3，±s)

ORI－BS/PC－MM 10.92±2.90 － (48.75±2.37)BS/PC－MM 8.88±0.90 －(49.53±1.69)

3.5 透射電鏡測定膠束形態(tài) 透射電鏡測定ORIBS/PC－MM粒徑為10 nm左右，粒徑分布均一，與激光粒度儀測定結(jié)果符合，膠束表面形態(tài)為類圓形實體。見圖6。

4 討論

通過上述實驗發(fā)現(xiàn)，影響ORI溶解性能的主要因素包括膽鹽、磷脂的性質(zhì)和藥物本身理化性質(zhì)，磷脂比例、輔料總濃度、水化介質(zhì)的pH值，離子強度，水化溫度等。選用純度較高的脫氧膽酸鈉、注射用大豆磷脂可以取得較好的增溶效果。ORI與膽鹽、磷脂的疏水部分具有較好的相容性;但是，固定輔料總濃度情況下，提高磷脂比例，ORI的溶解度是逐漸降低的，與多數(shù)文獻報道提高磷脂比例，增溶效果增加不一致。Hammand［8］報道，甾體類藥物潑尼松龍、雌二醇在BS/PC－MM中也表現(xiàn)出類似趨勢，這可能是由于上述藥物結(jié)構(gòu)類似、具有一定的兩親性，在混合膠束中增加磷脂比例，膠束的疏水內(nèi)核與親水外殼之間的柵欄層增加，導致部分藥物定向插于其中，溶解穩(wěn)定性下降所致。另外隨著磷脂含量的增加，也可能導致磷脂與膽鹽的結(jié)合率下降，導致剩余的磷脂在水溶液中析出，從而導致藥物析出。

圖6 ORI-BS/PC-MM透射電鏡照片

隨著輔料總濃度的不斷增加，ORI的溶解度也不斷增加，但是載藥量卻呈現(xiàn)下降趨勢。原因是當輔料總濃度增加到一定程度以后，可能導致混合膠束數(shù)量趨于飽和，系統(tǒng)難以在水溶液中進一步溶解。

ORI與混合膠束通過分子間作用力結(jié)合，水化介質(zhì)的pH值過高或過低都可以影響溶解效果，可能與分子間作用力在高電荷情況下不穩(wěn)定，容易導致ORI析出有關(guān);水化溫度過高或者加入過多鹽類，可能導致膠束的親水段水化程度降低，且在高的水化溫度和離子強度作用下，可能影響膠束的表面電荷分布，提高混合膠束的臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)，導致用于增溶的膠束數(shù)量減少，從而降低ORI的溶解度。

本研究解決了難溶性藥物ORI的溶解性問題，能夠滿足臨床用藥濃度要求，并獲得納米粒徑藥物;且其制備方法簡單易行，所需實驗條件溫和。有望開發(fā)成為ORI的新型藥物傳遞系統(tǒng)。

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