高 娜， 韓淑英*， 賈洪娟

(1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北唐山063000;2.唐山市人民醫(yī)院河北唐山063000)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病率逐年增加，已成為嚴重威脅人類健康的慢性病，其危害性不僅在于它的發(fā)病率高，更主要的是它所導(dǎo)致的慢性并發(fā)癥范圍極為廣泛，幾乎可以累及全身各組織器官。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者最嚴重的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病心力衰竭和猝死的主要原因［1］，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點和難點。目前糖尿病尚無特效藥物治療，西藥只是改善癥狀，中醫(yī)藥治療在這方面有著極大的優(yōu)勢與潛力。我室前期研究發(fā)現(xiàn):蕎麥花葉總黃酮(TFBFL)具有降糖、降脂、軟化血管、尤其對壓力負荷和去甲腎上腺素所致的心肌肥厚有保護作用［2］。葛根具有降壓、降血糖、降低血液黏度等作用［3］。TFBCP是由蕎麥花葉總黃酮和葛根等中藥提取物按照一定的比例混合而成。本實驗旨在研究TFBCP對2型糖尿病大鼠心臟損傷的保護作用，并探討其可能的機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂性SD大鼠70只，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(京)－2007－0001，在華北煤炭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗室喂養(yǎng)和實驗。

1.2 藥品與試劑

蕎麥花葉總黃酮的提取:蕎麥花、葉的自然干燥物加去離子水加熱回流提取2次(第1次加15倍量水，第2次加10倍量水)，每次1 h，合并2次濾液，濃縮至原液量的1/3～1/4，加分離劑，調(diào)pH為5，70～80℃加熱攪拌1 h，并趁熱過濾，濾液靜置沉淀，過濾得黃色沉淀物，經(jīng)70℃烤干，將干燥物碾成細粉，通過60目篩即為蕎麥花葉總黃酮，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所鑒定提取物中總黃酮含量可達90% ～95%。

葛根等中藥提取物的提取:葛根等中藥加水煎煮2次(第1次加15倍量水，第2次加10倍量水)每次煎煮1 h，合并2次濾液，80～90℃水浴上攪拌，濃縮成膏狀，放厚玻璃板上，80℃烤箱中干燥，將干燥物碾成細粉，通過60目篩。

TFBCP的制備:由蕎麥花葉總黃酮和葛根等中藥提取物按照一定的比例混合而成。

大鼠普通飼料和高脂飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)，胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號:20070105)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，游離脂肪酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TNF－α放射免疫分析藥盒(中國原子能科學(xué)院同位素研究所)，消渴丸(廣州中一藥業(yè)有限公司，批號:07100213)。

1.3 儀器 血糖儀(韓國All Medicus公司)，722型分光光度儀(北京市六一儀器廠)，數(shù)碼照相機(日本佳能公司)，HP－5500彩色超聲多譜勒儀(美國百盛公司)，光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(日本Nikon公司產(chǎn)品)，JEM－100CX 透射電鏡(日本)，F(xiàn)T630G型微機多探頭放免儀(北京市核儀器廠)。

2 方法

2.1 大鼠2型糖尿病模型的建立 大鼠普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，隨機取出12只作為正常對照組(Contorl組)，繼續(xù)給予普通飼料，其余58只給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后，用鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg(STZ用pH4.3的0.1 mol/L檸檬酸－檸檬酸鈉溶液稀釋成1%的溶液)腹腔注射，同時正常對照組腹腔注射檸檬酸一檸檬酸鈉溶液，一周后以同樣方法再注射1次［4］。72 h后，測空腹血糖在10 mmol/L以上者為造模成功。

2.2 分組與給藥 將成模2型糖尿病大鼠51只隨機分為5組:TFBCP低劑量(L－TFBCP)治療組13只，按每日0.6 g/kg灌胃給藥;TFBCP高劑量(HTFBCP)治療組13只，按每日1.2 g/kg灌胃給藥;消渴丸(XKW)治療組12只，按每日0.83 g/kg灌胃給藥;模型對照組13只，每天灌服相同容積生理鹽水，上述各組大鼠每天上午8點灌胃給藥，連續(xù)8周，同時各組按原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。

2.3 試驗指標測定

2.3.1 血糖、血脂、血清TNF－α的測定 末次給藥后禁食12 h，取尾靜脈血測FBG(血糖儀法)，比色法測定血清 TG、T－CHO和 FFA，放免法測定血清TNF－α 的水平。

2.3.2 心功能和心重指數(shù)(HWI)的測定 末次給藥后禁食12 h，稱體重，用10%水合氯醛麻醉，將大鼠放置于大鼠固定板上，固定四肢及頭部，胸前區(qū)以8%硫化鋇溶液褪毛，采用HP 5500型彩色超聲多普勒儀做超聲心動圖，探頭頻率7.5 MHz。將探頭置于胸骨左側(cè)，取胸骨旁左心室長軸切面，用M－型超聲測量左心室結(jié)構(gòu)和心功能參數(shù)(正常組、模型組和 H－TFBCP):LVEDD、LVESD、LVAWT、LVPWT、EF、FS由超聲儀自動計算輸出。取15個心動周期平均所得數(shù)作為測量值，超聲心動圖由從事超聲工作的專業(yè)醫(yī)生進行。然后迅速打開胸腔，腹主動脈取血，取出心臟，置于冰生理鹽水中反復(fù)沖洗，洗凈殘留積血，濾紙吸干，用分析天平稱取心臟重量，全心重/體重(hw/bw)為心重指數(shù)(HWI)。

2.3.3 光鏡和電鏡下觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變?nèi)∽笫倚募獠啃募〗M織置入10%中性甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、浸蠟、包埋、切片、片厚4 μm，HE染色光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。另取左室心肌剪成1 mm3大小，2.5%戊二醛前固定4 h，1%鋨酸固定1 h，乙醇逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片(片厚70 nm)，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察攝片。

2.3.4 免疫組織化學(xué)法測定心肌TNF－α蛋白的表達 載玻片采用多聚賴氨酸(分子量＞3×105)行防脫片處理，采用SABC法進行免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒說明操作。陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。

2.3.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TFBCP對 2型糖尿病大鼠 FBG、TNF－α 和HWI的影響 與正常對照組相比，模型組FBG、血清TNF－α、HWI明顯升高(P＜0.01)。各治療組能一定程度的降低 FBG、血清TNF－α、HWI的水平，尤其蕎麥黃酮復(fù)方制劑高劑量組作用最顯著。見表1。

表1 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對各組大鼠空腹血糖、腫瘤壞死因子-α、心重指數(shù)的影響(±s)

表1 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對各組大鼠空腹血糖、腫瘤壞死因子-α、心重指數(shù)的影響(±s)

與正常對照組比較，*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 數(shù)量/只 FBG/(mmol/L) TNF－α/(fmol/mL) HWI/(mg/g)12 5.32±2.17 7.21±0.61 3.14±0.17模型對照組 13 17.82±2.42* 9.67±0.48* 4.28±0.20*消渴丸組 12 13.89±3.46 8.85±0.46△ 4.11±0.15 TFBCP低劑量組 13 13.82±3.56△ 8.92±0.62△ 4.06±0.18△TFBCP高劑量組 13 13.25±3.30△△ 8.66±0.51△△ 3.66±0.12正常對照組△△

3.2 TFBCP對T2DM大鼠血脂的影響 模型組大鼠TG、T－CHO、FFA含量明顯高于正常對照組(P＜0.01);與模型對照組相比，TFBCP高、低劑量組TG、T－CHO、FFA 含量有不同程度降低(P ＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對各組大鼠甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸的影響(±s)

表2 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對各組大鼠甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸的影響(±s)

與正常對照組比較*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 數(shù)量/只 TG/(mmol/L) T－CHO/(mmol/L) FFA/(μmol/L)正常對照組12 0.48±0.11 1.30±0.25 442.7±12.3模型對照組 13 0.73±0.15* 1.83±0.30* 555.4±14.7*消渴丸組 12 0.68±0.13 1.78±0.10 535.1±14.1△TFBCP低劑量組 13 0.62±0.12△ 1.71±0.11△ 536.8±11.1△TFBCP高劑量組 13 0.59±0.15△ 1.59±0.14△△ 533.6±12.4△△

3.3 光鏡結(jié)果 心肌組織HE染色:光鏡下可見正常對照組大鼠心肌組織無形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變(圖1A);模型組大鼠心肌細胞明顯腫脹肥大、變性、核明顯增大，心肌細胞間成纖維細胞增生，膠原纖維增加，心肌纖維排列紊亂(圖1B);TFBCP高劑量組心肌細胞腫脹減輕，病變程度有所改善(圖1C)。

圖1 心肌組織HE染色光鏡結(jié)果

3.4 電鏡結(jié)果 電鏡下正常組心肌細胞的各帶結(jié)構(gòu)清晰，質(zhì)膜下吞飲小泡豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完好，嵴密集排列，基質(zhì)密度適中(圖2A);模型組大鼠可見到心肌細胞中線粒體數(shù)目增多，排列紊亂，擠壓，且線粒體腫脹變性，有空泡化，嵴斷裂，稀疏(圖2B);TFBCP高劑量組大鼠可見肌絲排列趨于正常，明暗帶較清晰，線粒體病變減輕(圖2C)。

圖2 電鏡下心肌細胞

3.5 免疫組織化學(xué)染色分析 TNF－α染色陽性信號為棕色顆粒，定位于心肌細胞胞漿內(nèi)。對照組心肌細胞胞漿內(nèi)可見分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒(圖3A);模型組心肌細胞內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒(圖3B);TFBCP高劑量組的心肌細胞呈散在的棕色顆粒，較模型組明顯減少(圖3C)。

3.6 TFBCP對T2DM大鼠心功能的影響 超聲心動圖顯示:與對照組相比，糖尿病模型組大鼠心臟左心室結(jié)構(gòu)和功能有明顯變化，LVAWT，LVPWT，LVEDD、LVESD增加(P＜0.01)，EF及 FS下降(P＜0.01)，顯示心功能降低。TFBCP高劑量組大鼠的心臟功能有明顯改善，與模型對照組比較有顯著差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。(見表3)。

4 討論

DCM是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病晚期死亡的主要原因。延緩DCM的病理進程，對改善預(yù)后、降低死亡率有重要的臨床意義。研究表明糖尿病代謝異常能導(dǎo)致心肌代謝異常、心肌收縮和舒張功能降低及心肌超微結(jié)構(gòu)的改變。本研究是以高脂高熱量飲食加小劑量STZ注射建立的大鼠T2DM模型，結(jié)果顯示:模型組的血糖、血脂、心重指數(shù)較正常組有明顯的升高(P＜0.01)，而TFBCP治療后的大鼠空腹血糖、血脂、心重指數(shù)有所降低，光鏡和電鏡下觀察心肌的病理損傷明顯減輕，心臟超生心動圖結(jié)果顯示左室舒張和收縮功能均減退，提示已成功地建立了2型DCM模型。

圖3 免疫組織化學(xué)染色分析

表3 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對2型糖尿病大鼠心功能的影響(±s)

表3 蕎麥黃酮復(fù)方制劑對2型糖尿病大鼠心功能的影響(±s)

與正常對照組比較，*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

LVEDD/mm LVESD/mm LVAWT/mm LVPWT/mm FS EF正常對照組 12 0.51±0.29 0.28±0.03 1.45±0.13 1.38±0.02 5組別 數(shù)量2.71±3.05 57.72±3.53模型對照組 13 0.83±0.01b 0.47±0.05b 1.73±0.07b 1.59±0.03b 35.74±5.12b 45.56±4.07b TFBCP高劑量組 13 0.62±0.12c 0.35±0.14c 1.64±0.11 1.51±0.12 47.37±1.13d 50.64±2.35c

研究表明:血脂升高，尤其是游離脂肪酸含量升高可以下調(diào)靶細胞膜胰島素受體數(shù)量，并影響其親和力，干擾胰島素受體酶聯(lián)系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)，抑制糖的氧化和非氧化途徑。FFA短期升高能刺激胰島細胞產(chǎn)生胰島素，長期作用則促進胰島細胞凋亡［5］。本實驗結(jié)果表明:TFBCP高、低劑量組能夠不同程度降低2型糖尿病大鼠的血脂含量，因此推測TFBCP可能是降低體內(nèi)血脂，尤其是通過降低FFA含量，改善FFA所致的胰島素抵抗，及其對糖的氧化和非氧化途徑的抑制，從而達到對2型糖尿病的保護作用。

TNF－α是細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，具有多種生物學(xué)活性，它具有抗病毒、抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的作用，但過量的TNF－α作為炎癥介質(zhì)可介導(dǎo)免疫損傷及一些嚴重的病理生理過程。在大鼠輸注TNF－α觀察到左室壁變厚、心肌間質(zhì)纖維膠原減少50%(與對照組比較)。在過度表達TNF－α的轉(zhuǎn)基因小鼠上，發(fā)現(xiàn)有細胞凋亡、心臟間質(zhì)纖維化、心臟間質(zhì)的浸潤細胞數(shù)量的增加。提示TNF－α水平增加可能引起心肌細胞空間排列紊亂及細胞外基質(zhì)改變，從而引起心室重構(gòu)，左室功能紊亂，最終導(dǎo)致心功能不全［6］。本實驗結(jié)果表明糖尿病模型組大鼠TNF－α水平明顯高于正常對照組，心重指數(shù)增加，左心室前壁厚度、后壁厚度輕度增加，左心室舒張末期直徑、收縮末期直徑明顯增加，光鏡和電鏡下觀察心肌的病理損傷，尤其線粒體的損傷嚴重，證實模型組糖尿病心肌病變的形成。給予TFBCP治療后，糖尿病大鼠血清TNF－α水平下降，同時心重指數(shù)降低，超聲心動圖顯示高劑量TFBCP能明顯改善心臟功能，心肌的病理損傷明顯減輕，說明TFBCP對糖尿病大鼠心肌的損害具有一定的抑制作用，其機制可能是TFBCP抑制TNF－α的產(chǎn)生而發(fā)揮保護心肌作用的。

血糖、血脂、TNF－α三者之間是密切聯(lián)系，互相影響的。有報道TNF－α通過抑制脂肪合成酶的活性提高脂肪組織和脂肪細胞中的脂肪動員，可顯著加強脂肪細胞分泌 FFA［7］。也有人認為 TNF－α通過阻斷脂肪細胞內(nèi)的腺營活性降低Gi蛋白濃度，從而使細胞內(nèi)cAMP濃度上升，最終導(dǎo)致脂肪分解增多及 FFA水平升高［8］。本研究也表明 TNF－α 與FFA呈高度正相關(guān)。另外，F(xiàn)FA抑制葡萄糖氧化，這己被Randle提出的葡萄糖一脂肪酸循環(huán)學(xué)說己證實;FFA有促進糖異生的作用，并且長期高濃度的FFA也可通過損傷胰島β細胞功能，使胰島素分泌減少從而使糖異生增加［9］。

本課題組前期大量研究證明蕎麥花葉總黃酮有降糖、降脂、抗炎、抗氧化等作用。葛根具有降壓、降血糖、降低血液黏度、改善微循環(huán)等作用，蕎麥花葉總黃酮和葛根素在體外有抑制非酶糖基化反應(yīng)的作用。研究顯示:葛根對正常小鼠空腹血糖無明顯影響，但可明顯降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖和血清胰島素水平，使胰島素敏感性指數(shù)顯著升高［10］。本研究將TFBFL與葛根等中藥提取物聯(lián)合應(yīng)用于2型糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)其對2型糖尿病大鼠心肌損傷具有保護作用，其機制可能是TFBFL和葛根素等多種成分的共同作用或/和其中的代謝產(chǎn)物發(fā)揮多途徑、多靶點的綜合作用產(chǎn)生的，確切機制有待進一步研究。

［1］Sowers JR，Epstein M，F(xiàn)rohlich ED.Diabetes，hypertension and cardiovascular disease:an update［J］.Hypertension，2001，37(4):1053－1059.

［2］韓淑英，梁永平，薛書霞，等.蕎麥花葉總黃酮對心肌肥厚及原癌基因 c－fos表達的影響研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，24(19):1815－1817.

［3］玉從榮，呂俊華，王 丹.葛根素抗氧化作用與改善胰島素抵抗綜合征模型大鼠胰島素敏感性、血壓和血脂作用的實驗研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2006，40(4):53－55.

［4］張芳林，李 果，劉優(yōu)萍，等.長期高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素建立人類普通2型糖尿病大鼠模型的研究［J］.中國實驗動物學(xué)報，2003，11(3):138－141.

［5］Vettor R，Lombardi AM，F(xiàn)abris R，et al.Substrate competation and insulin action in animal models［J］.Int J Obes Relat Metab Disord.2000，24(Suppl 2):22－24.

［6］Li YY，F(xiàn)eng YQ，Kadokami T，et al.Myocardial extracellular matrix remodeling in transgenic mice overexpressing tumor necrosis factor－α can be modulated by antitumorne－crosis factor－α therapy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(5):12746－12751.

［7］Sun M，Chen M，Dawood F，et al.Tumor necrosis factor－alpha mediates cardiac remodeling and ventricular dysfunction after pressure overload state［J］.Circulation，2007，115(11):1398－1407.

［8］Klein JB，Wang GW，Zhou Z，et al.Inhibition of tumor necrosis factor－alpha－dependent cardiomyocyte apoptosis by metallothionein［J］.Cardiovasc Toxicol，2002，2(3):209－218.

［9］Ana TM，Guenther B，Maria ERS，et al.Ovemight lowing of free fatty aeid with Acipimox improves insulin resistance and glucose tolerance in obese diabetic and nondiabetic subjeets［J］.Diabetes，1999，48(8):1836－1841.

［10］曹 莉，顧振綸，茅采萍.葛根素對糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響［J］.中草藥，2006，37(6):901－904.