杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠方

（河南大學免疫學研究所河南大學醫(yī)學院河南大學天然藥物與免疫工程省級重點實驗室,開封 475001）

抗人DR5功能性單克隆抗體誘導Jurkat細胞凋亡的線粒體途徑的分子機制①

杜耀武 柴立輝 黃紅瑩 白慧玲 趙粵萍 馬遠方

（河南大學免疫學研究所河南大學醫(yī)學院河南大學天然藥物與免疫工程省級重點實驗室,開封 475001）

目的:探討抗人死亡受體5（DR5）功能性單克隆抗體（mDRA-6）對Jurkat細胞誘導凋亡的線粒體途徑的分子機制。方法:MTT法檢測單克隆抗體（mDRA-6）對Jurkat細胞生長抑制作用的劑量-效果及時間-效果關系;JC-1單染流式細胞術定量分析技術對凋亡的Jurkat細胞線粒體膜電位的變化進行分析;免疫印跡技術檢測凋亡細胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等凋亡相關蛋白的表達情況。結果:mDRA-6對Jurkat細胞抑制具有明顯劑量-效果和時間-效果關系;流式細胞儀檢測顯示,2.0μg/m l濃度的mDRA-6作用15、30、60和120分鐘時,Jurkat細胞線粒體膜電位改變率分別為 20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐漸增高趨勢。免疫印跡技術檢測顯示,mDRA-6作用后,Jurkat細胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c等表達活性增加,并且Cyto c在線粒體內為遞減而在胞漿呈遞增的表達現(xiàn)象。結論:mDRA-6通過激活外源性膜受體,繼而啟動細胞線粒體途徑導致Jurkat細胞凋亡。本研究為mDRA-6對白血病治療奠定實驗基礎。

死亡受體5;單克隆抗體;Jurkat細胞;細胞凋亡

1995年Wiley等[1]報道,腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRA IL）可與腫瘤細胞膜相應的死亡受體（Death receptor）DR4和/或DR5結合,誘導細胞凋亡。自此,對TRAIL及其DR4/DR5的研究一直備受關注,針對DR4及DR5的功能性單抗HGS-ETR1（Mapatumumab）和HGS-ETR2（Lexatumumab）等正在進行臨床一期或二期實驗研究。Hotte等以不同劑量的Mapatumumab對41例實體惡性腫瘤患者（其中結腸癌10例、卵巢癌 9例、宮頸癌5例、乳腺癌 3例、肺癌4例等）進行治療結果表明,12位（29.3%）患者的治療有效、病情穩(wěn)定[2];Plummer等以不同劑量Lexatumumab對37例實體惡性腫瘤患者進行治療后,13位（35.1%）患者的治療結果較好[3]。我國鄭德先教授研制的抗DR5功能性單克隆抗體AD5-10,也正在進行抗腫瘤的體內外實驗研究[4]。

本實驗室以可溶性人DR5（rhDR5）胞外段蛋白對BALB/c小鼠進行免疫獲得了抗人DR5單克隆抗體,被命名為mDRA-6[5],此抗體可誘導Jurkat細胞及其它腫瘤細胞凋亡[6-8],并初步探明該抗體誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制與膜受體途徑凋亡有關[8]。本研究仍然以TRA IL敏感的Jurkat細胞株為靶細胞,探討線粒體凋亡途徑的蛋白分子機制在DRA-6誘導Jurkat細胞凋亡中意義,為mDRA-6的臨床試驗進一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗體和細胞系 抗人DR5單克隆抗體mDRA-6為本實驗室制備[5];山羊抗人Caspase-8、9 IgG多克隆抗體及兔抗人Caspase-3 IgG單克隆抗體購于R&D公司;山羊抗人Bid（tbid）、Cyto c、Actin多克隆抗體,山羊抗人 BCl-2、Bax單克隆抗體購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊、山羊抗兔等IgG（H+L）購自北京中杉金橋公司。Jurkat細胞為TRAIL敏感株,由美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院病理與實驗醫(yī)學系陳有海教授饋贈,培養(yǎng)于2mmol/L L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10mmol/LHEPES、1mmol/L丙酮酸鈉、10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在 37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng),實驗時取對數(shù)生長期的細胞。

1.2 主要材料與試劑 RPMI 1640、胎牛血清、四氮唑藍（MTT）購自GIBCO公司;rhTRAIL、DMSO購自Sigma公司;細胞線粒體分離及膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Western blot試劑盒及IP細胞裂解液購自Beyotime公司;ECL顯影試劑盒購自Santa Cruz公司;流式細胞儀（FACSCalibur）為BD公司產(chǎn)品;垂直電泳儀及電轉裝置為Thermo EC公司產(chǎn)品;凝膠圖像分析儀（Alphalmager2200）為A lpha Inntech公司產(chǎn)品;數(shù)碼相機為Nikon公司產(chǎn)品。

1.3 mDRA-6對Jurkat細胞毒作用檢測 將密度為2.0×105m l-1的Jurkat細胞加于96孔平底型細胞培養(yǎng)板,100μl/孔,培養(yǎng)8小時作對細胞增殖作用的劑量-效果的檢測。加mDRA-6液100μl,使第1孔的抗體濃度為5.0μg/ml,然后倍比稀釋依次至第2、第3……第10孔,第11孔為不加mDRA-6的陰性對照,第12孔為不加細胞的空白對照;以rhTRAIL作為對照;每個濃度做3個復孔。置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內孵育12小時,1 000 r/min離心5分鐘,吸出150μl上清,加入新培養(yǎng)液130μl/孔,加MTT（5.0 mg/m l）20μl/孔,繼續(xù)孵育4小時。離心后小心移棄上清。加DMSO,150μl/孔,避光振蕩混和10分鐘,全自動酶標儀測OD570值。

將相同密度的Jurkat細胞加于7塊96孔平底型細胞培養(yǎng)板內作對細胞增殖作用的時間-效果的檢測,第1孔加入mERA-6為100μl,使其終濃度為0.5 μg/ml,第2孔為不加mDRA-6的陰性對照,第3孔為空白對照,每個濃度做3個復孔,以rhTRAIL作為對照 。繼續(xù)于培養(yǎng)箱內孵育,依次于 2、4、6、8、10、12小時取培養(yǎng)板,依照上述方法加入MTT及DMSO,全自動酶標儀測OD570值。

所有實驗重復3次,取平均值。計算Jurkat細胞死亡率和存活率。細胞死亡率（%）=100%-細胞存活率;細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白OD值）/（對照組OD值-空白OD值）×100%）。

1.4 線粒體膜電位（Mitochondrialmembrane potential,ΔΨm）檢測 將密度為 6.0×105m l-1的Jurkat細胞加于一組6孔板內,0.5 ml/孔,每孔加入mDRA-6,使其濃度為2.0 μg/m l,對照孔不加 。于15、30、60和120分鐘時依次收集每孔細胞,離心棄上清,加入0.5m l JC-1染色工作液,混勻后置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育20分鐘。離心后棄上清,加入緩沖液1ml混勻置冰上,以流式細胞技術檢測細胞線粒體膜電位的變化,用CellQuest軟件進行分析。

1.5 參與Jurkat細胞凋亡線粒體途徑的蛋白分子檢測 將密度為6.0×105ml-1的Jurkat細胞加于兩組6孔板內0.5 ml/孔,加入mDRA-6,使其濃度為2.0μg/ml,對照孔不加。于 15、30、60和120分鐘時依次收集每孔細胞,離心棄上清,其中一組每管加入Western及IP細胞裂解液300μl充分混勻,置冰上30分鐘,10 000 r/m in低溫離心1分鐘,吸取上清;另一組以細胞線粒體分離試劑獲取每份樣品的線粒體裂解蛋白;BCA法測定每份樣品的蛋白總量,于12%～18%的SDS-PAGE進行電泳分離蛋白[9],隨后,將蛋白轉至 PVDF膜上,加入Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cyto c 等一抗,與 PVDF 膜在室溫下孵育1小時,以PBST（含0.1%Tween 20的PBS）洗6次,10分鐘/次。加入二抗,室溫孵育1小時,以PBST洗去未結合抗體,以Kodak X-AR膠片記錄ECL法檢測結果。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析和t檢驗和方差分析,藥物作用Jurkat細胞的劑量-效果關系及時間-效果關系的分析作用采用直線回歸分析,實驗結果以±s表示,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 mDRA-6對Jurkat細胞的毒性作用[8]不同濃度的mDRA-6作用12小時后,Jurkat細胞的死亡率明顯增高,當濃度為4.9l～1 250 ng/ml時細胞的死亡與mDRA-6呈明顯的量-效關系,見圖1A。以0.5 μg/m l的 mDRA-6 作用 2、4、6、8、10、12 小時時 ,Jurkat細胞死亡率明顯增加,與mDRA-6作用時間呈明顯的時-效關系（r=0.928,P=0.008）;作為對照,相同濃度的rhTRAIL作用相同時間時,Jurkat細胞死亡率為 9.22%、17.39%、38.78%、47.18%、51.98%、58.08%,結果見圖1B。本檢測證明,相同濃度的mDRA-6及rhTRAIL作用于Jurkat細胞時,無論從量-效關系,還是從時-效關系上比較,mDRA-6誘導細胞凋亡的效果高于rhTRAIL。

2.2 mDRA-6對Jurkat細胞線粒體膜電位（ΔΨm）的影響經(jīng)JC-1單染后流式細胞學分析結果顯示,以2.0μg/m l的mDRA-6作用Jurkat細胞15、30分鐘和1、2小時后,Jurkat細胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,提示 mDRA-6可以導致線粒體膜電位降低,見圖2。

2.3 mDRA-6對Jurkat細胞凋亡相關蛋白表達的影響 以2.0μg/m l的mDRA-6作用后,Western blot法檢測 Jurkat細胞Caspase-8、3、9 及 Bid 、Bax、Bcl-2、Cyto c表達結果顯示 ,Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9表達水平明顯增強;Bid酶原、Bcl-2隨作用時間的延長表達水平逐漸減少、而激活的tbid、Bax和Cyto c表達水平逐漸增加,而線粒體內的Cyto c逐漸減少,證明Cyto c隨著作用時間的延長由線粒體基質外溢至胞漿中,佐證了JC-1單染線粒體膜電位（ΔΨm）的變化,見圖3。

3 討論

自Wiley等報道TRAIL之后的十多年間,針對促凋亡受體激動劑（Proapoptotic receptor agonists,PARAs）的研究一直是方興未艾,目前文獻報道的針對DR4/DR5的功能性抗體約有8個[10],有的已經(jīng)用于臨床Ⅰ期試驗,并取得了一定的療效[2-4]。mDRA-6是本實驗室研制的針對人DR5的功能性單克隆抗體,與rhDR4、rhDcR1、rhDcR2和 rhFas等無交叉反應,能與腫瘤細胞膜表面的DR5結合誘導腫瘤細胞凋亡,其誘導凋亡作用可以被 rhDR5完全阻斷[5]。mDRA-6無需交聯(lián)即可誘導多種腫瘤細胞凋亡,并與化療藥物具有協(xié)同殺傷腫瘤細胞的作用[11,12]。

圖1 mDRA-6、rhTRAIL對Jurkat細胞死亡率Fig.1 The dose-dependence and time-dependence of Jurkat cell death treated bymDRA-6&rhTRAIL

圖2 mDRA-6誘導Jurkat細胞調亡的流式細胞儀分析結果Fig.2 Analysis Jurkat cellapoptosis treated bymDRA-6 with JC-1 stain by FCM

圖3 Western blot檢測mDRA-6作用 Jurkat細胞相關凋亡信號的結果Fig.3 Activation of caspase cascade and apoptotic proteins were tested by Western b lot

我們的前期實驗結果顯示,mDRA-6可誘導Jurkat細胞凋亡[8],可使 Jurkat細胞 Caspase-8、3、9 均被激活,Caspase-8抑制劑對Jurkat細胞凋亡的抑制作用遠高于Caspase-3、9抑制劑的作用[8]。初步證實,mDRA-6對Jurkat細胞的凋亡作用與其它已知的DR5的功能性單抗AD5-10、TRA-8等具有相似的膜受體凋亡機制[4,13]。本實驗在前期工作的基礎上,對分析了對Jurkat細胞線粒體膜電位改變的分析,免疫印跡顯示 Bid（tbid）、Bax、Bcl-2、Cyto c等與線粒體途徑凋亡相關的蛋白分子的變化情況。

線粒體膜電位（ΔΨm）的下降是細胞早期凋亡的一個標志。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物（J-aggregates）,產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體基質中,此時JC-1為單體（monomer）,產(chǎn)生綠色熒光。所以,用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。當以2.0μg/ml的mDRA-6作用15分鐘、30分鐘、1小時、2小時后,Jurkat細胞線粒體膜電位下降率分別為20.14%、19.34%、21.11%、30.90%（見圖 2）,此結果與mDRA-6對Jurkat細胞毒性作用的量-效關系及時-效關系的結果分析不一致,遠低于相當劑量時Jurkat的細胞死亡率,提示mDRA-6在通過降低線粒體膜電位引起細胞凋亡的同時,還有其它誘導細胞凋亡的途徑[8]。

蛋白免疫印跡檢測結果顯示,隨著mDRA-6的作用時間延長,Caspase-8、3、9和Bax活性片段表達均呈現(xiàn)漸進式增加,在120分鐘時活性片段表達最強。Bid（tbid）Bid酶原表達逐漸減少、而激活的tbid表達逐漸增加,對凋亡有抑制作用的Bcl-2表達逐漸減少、而對凋亡起促進作用的Bax卻表達逐漸增多;同時,Cyto c表達增加,在120分鐘時表達最強,而線粒體內的Cyto c表達逐漸減少,在120分鐘處幾乎沒有表達,提示隨著mDRA-6對Jurkat細胞作用時間延長,Cyto c由線粒體基質大量外溢至胞漿中,進而導致細胞的凋亡（見圖3）。

細胞凋亡主要通過兩種既獨立又彼此相關的信號傳導機制:一種是外源性的膜受體途徑,通過激活細胞膜表面的凋亡受體;另一種是內源性的線粒體途徑,通過激活細胞內的線粒體信號。這兩者匯集于效應分子Caspases,協(xié)調引導細胞凋亡[14]。對由Fas相關死亡結構域（Fas-associated death domain,FADD）及Caspase-8和/或Caspase-10啟動的腫瘤細胞凋亡機制的研究中,發(fā)現(xiàn)有兩種不同類型的凋亡機制在相應的細胞中起重要作用。Ⅰ型細胞中Caspase-8和/或Caspase-10作用于Caspase-3的二聚體酶原結構而引起Caspase-3活化[15],激活的Caspase-3消化分解包括ICAD（Inhibitorof Caspase-activated deoxyribonuclease）在內的構成細胞基本結構的多種蛋白成分,而ICAD的破壞導致CAD的活化,后者引起細胞DNA降解,最終導致細胞凋亡[16]。Ⅱ型細胞中,可能因凋亡抑制蛋白XIAP（X-chromosome linked Inhibitory of Apoptosis Protein）的影響使Caspase-3不能被有效地激活、啟動凋亡進程,從而通過Caspase-8和/或Caspase-10啟動了BID（Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein,BID）激活為活性狀態(tài)的tbid[17],與Bax（Bcl-2-associated X protein）共同插入線粒體外膜層,使線粒體內膜亦破壞崩解而引起Cyto c等外溢[18],再與Apaf-1（Apoptotic protease activating factor 1）、Pro-caspase-9和dATP形成一種被稱之為apoptosome的復合體,這種復合體二聚化再激活Caspase-9,進一步放大Caspase-3的激活而誘導腫瘤細胞的凋亡[19]。

本實驗結果提示,mDRA-6誘導的Jurkat細胞凋亡的過程中,通過線粒體途徑誘導細胞凋亡具有很重要的作用。mDRA-6首先作用于細胞膜表面的DR5,激活受體形成三聚體進而募集細胞內的轉接分子Pro-caspase-8,使后者進一步成為活化狀態(tài)的Caspase-8,通過外源性的膜受體凋亡途徑進一步激活下游的效應分子Caspase-3、9,繼而作用于死亡底物發(fā)生凋亡。同時,活化的Caspase-8激活Bid形成有活性的tbid,在促進凋亡的Bax分子參與下,消減抗凋亡分子Bcl-2對線粒體膜的穩(wěn)定作用,破壞線粒體膜的完整性,引起線粒體膜電位下降,導致Cyto c由線粒體基質外溢至胞漿中而促使細胞的凋亡。本研究及我們的前期工作提示,mDRA-6誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制可能與mDRA-6首先激活外源性的膜受體途徑,繼而啟動細胞內源性的線粒體途徑[8],通過細胞凋亡的兩種途徑導致Jurkat細胞凋亡的。詳細機制參見圖4。

mDRA-6誘導 Jurkat細胞凋亡過程中,有無JUK/P38/PARP途徑的參與,Smac/DIABLO 、P53、NF-κB等分子的表達如何仍不清楚,還需要進一步實驗?？谷薉R5的功能性單克隆抗體mDRA-6是一種具有誘導腫瘤細胞凋亡活性的功能性抗體,將其人源化改造后可有效地用于抗腫瘤生物治療,可為TRAIL/DR5系統(tǒng)的抗腫瘤應用提供一種新的生物治療制劑。

圖4 mDRA-6誘導Jurkat細胞凋亡的分子機制示意圖Fig.4 Themolecu lar mechanisms of mDRA-6 inducing apoptosis in Jurkat cells

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[收稿2009-06-07 修回2009-09-24]

（編輯 許四平）

Them itochondrial-dependentmolecular mechanisms for inducing apoptosis in Jurkat cellsby a novelagonistic anti-human DR5monoclonal antibody

DUYao-Wu,CHAILi-Hui,HUANGHong-Ying,BAIHui-Ling,ZHAOYue-Ping,MAYuan-Fang.InstituteforImmunologyofHenanUniversity,MedicalCollegeofHenanUniversity,TheKeyLaboratoryofNaturalDrug&ImmunologyEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475001,China

Objective:To investigatemitochondrial-dependentmolecularmechanisms of a novel agonistic anti-human death receptor 5（DR5）monoclonal antibody（mDRA-6）inducing apoptosis in Jurkat cell.Methods:The dose-dependent and time-dependent cellgrow th suppression ofmDRA-6 in Jurkat cellswas determined by MTT assay.Themeasurement of them itochond rial transmembrane potential（ΔΨm）of Jurkat cellswasdetected by flow cytometrywith JC-1 single staining.Caspase-8,9 aswell as Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c of apoptotic Jurkat cells were analyzed byWestern blotaftermDRA-6 treatment.Results:ThemDRA-6 induced cellgrow th suppression and cytotoxicity in dose-dependentmanner and time-dependentmanner.AftermDRA-6 treatment at2.0μg/ml for15min,30min,60min and 120min,the change inΔΨm were 20.14%,19.34%,21.11%and 30.90%respectively by JC-1 single staining.Western blot revealed that the levelofactive fragmentsof Caspase-8,9 and Bid,Bax,Bcl-2 and Cyto c respectively,and the amountof Cyto cwasincreased in cytosol concomitantwith the related attenuation of Cyto c inmitochondria.Conclusion:Apoptotic pathway of Jurkat cells induced bymDRA-6 is initiated upon DR5 ligation tomDRA-6 and exogenic Caspase-dependent cell apoptotic cascades is activated,and endogenicmitochondrial-dependent cell apoptosis pathway is activated.mDRA-6may be ausefu lagent in investigating human leukemia therapy by using TRAIL/DR5.

Death recptor5;Monoclonal antibody;Jurkat cell;Apoptosis;Western blot

R392.11

A

1000-484X（2010）01-0003-05

①本文受國家863重大專項子課題（No.2006AA02A 254）及河南省杰出人才創(chuàng)新基金項目（No.074200510014）的資助

杜耀武（1971年-）,男,醫(yī)學碩士,副教授,主要從事腫瘤免疫學研究,E-mail:dyw711@henu.edu.cn;

及指導教師:馬遠方（1960年-）,男,醫(yī)學博士,教授,博士生導師,主要從事腫瘤免疫與抗體工程研究,E-mail:mayf@henu..edu.cn。